' Z6 G3 a8 \; u7 S/ y5 U 【ABSTRACT】 Objective: To study the feasibility of exogenous gene transfecting into bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: MSCs were cultured and treated with pEGFPC1 with the help of lipofectamine. The transgene results were confirmed by fluoroscopy and the cell viability after transfection was evaluated by light microscopy and electron microscopy. Results: Bone marrow MSCs were successfully transfected with pEGFPC1 gene. Conclusion: The MSCs originated from rat bone can be cultured in vitro under appropriate conditions, and they can be directly used as gene target cells. Moreover, it is feasible to construct the MSCs expressing EGFP stably, which can be further applied to label target cells in the transplantation study. % u8 b% x! {/ u2 _( K' ^* I ) L v6 N, U6 K# g/ F6 T 【KEY WORDS】 Enhanced green fluorescent protein(EGFP); Transfection; Mesenchymal stem cells(MSCs)) D4 D3 r/ r( w% M& t2 x
; I4 q0 p' f( b 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）由于具有自我更新，多向分化的潜能，且容易获取和体外扩增培养，成为近年来干细胞研究的热点。迄今为止，国内外已对MSCs培养、生物学特性及治疗应用等进行了大量研究，展示了这种成体干细胞良好的应用前景 [1~4]。对MSCs研究主要包括：细胞特异性表面抗原、体外大量扩增技术、干细胞可塑性、细胞体内分布功能和治疗应用等。我们利用建立的MSCs培养，通过质粒转染并筛选培养对其用增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）进行标记，为其应用于干细胞移植实验打下良好基础。 & `) h+ s# j7 k* R" ]9 @ w% v( M* R* G
1 材料和方法 8 r0 v. e! v9 q1 ], [% p. n( R; D: T# x
11 材料pEGFPC1质粒（本室保存），G418购自GIBCO BRL公司，胎牛血清、脂质体转染试剂盒购自Roche公司，DMEM培养基购自Hyclone公司，PERCOLL细胞分离液购自天津TBD公司，日本大耳白兔购自四川大学动物中心。 # ?2 i! s' W3 ?: |$ V/ [% u G6 ~: p2 V
12 方法* P6 _6 a7 l" L* l; N
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121 兔骨髓MSCs的培养 （1）原代培养：在无菌条件下，从日本大耳白兔股骨转子处进行骨穿，抽出骨髓细胞抗凝后用DMEM培养液进行稀释，将细胞悬液缓慢加入离心管中PERCOLL分离液（密度1073g/ml）液面，进行离心，DHanks液洗涤两次，分离细胞，加入DMEM低糖型完全培养液（10%胎牛血清），接种于培养瓶中，48h后首次换液，以后每三天换液一次，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养[5]。（2）传代培养：待细胞克隆完全形成后，进行胰酶消化传代。当第二代细胞长满时，将稳定生长的细胞传入25 mm培养盘中，当细胞生长至50%~80%融合后进行转染。0 _2 R% r6 Y6 d8 @! d( s9 {
( X3 B0 t' v5 d' ]9 F | 122 基因转染 按脂质体转染试剂盒说明书进行操作，实验中设未转染的细胞作为对照。 , `" t1 v: _0 h! U% F' _. L( Z& x% e- \8 p( k& m; s3 r' B
123 阳性克隆的筛选和荧光显微镜观察 细胞转染48h后用荧光显微镜观察瞬时转染效率，然后换筛选培养基，其中加入G418（400×106g/L），三天换液一次，维持筛选作用。期间用普通显微镜观察细胞死亡情况。两周后对照细胞完全死亡，转染细胞单克隆形成，此时进行荧光显微镜观察稳定转染效率并照相。 ( N3 ~- w. [# j( F# @' S; t 2 X1 s) ^$ l, G 2 结果+ p w+ Y" S, B0 R% I$ y/ Z! V8 f
' Y5 ~* p0 ~1 A* ~. t5 u% F 21 MSCs细胞的形态观察 (1)原代细胞呈条索状少数呈多边形，几天后形成细胞克隆，这时细胞成堆出现。(2)打散克隆进行传代，二代细胞已经开始稳定生长并且可以平铺培养瓶底。5 }: [* S5 u6 h
