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标题: 我做的“ips”，请战友们指点（附图） [打印本页]
作者: 小刀    时间: 2010-4-28 22:40     标题: 我做的“ips”，请战友们指点（附图）

本帖最后由 细胞海洋 于 2010-4-28 23:02 编辑
9 o% ~! L! p2 m$ o' w' o, c
4 H; L9 Z9 y0 @" ]做了大概半年的ips诱导。总之很是不顺利。现诱导四十余日，图片如下，望前辈战友指点
" J, H3 c% y. ~[attach]6983[/attach]1 l- F! {( }' p! w5 l8 H* e
[attach]6984[/attach]: F0 n2 Z; N) h( W( `
[attach]6982[/attach]
8 Z( I6 q; n3 h8 w5 P" ]2 r   诱导体会：
* k1 E; S, [3 `+ U   1。在诱导过程中大约二十五六天时感觉镜下可见克隆特别多，但是，没几日，克隆就会迅速减少。我是隔日换液，考虑可能因为换液不勤导致克隆分化4 H4 O) X; {1 L9 H3 z& z# L- P
   2.MEF 处理后，细胞生长速度仍然较快，于是就产生了，大量MEF生长的状况8 o) o6 U  {7 H, h! f9 }
   3.貌似的小克隆总是不见其生长扩大，不知道原因为何？莫非不是？
作者: 小刀    时间: 2010-4-28 22:50

另外，ips是不是如昙花一现般的即将谢掉了啊？0 b) P8 F5 |- g8 Y2 d
前辈们请高见！
作者: daviehe    时间: 2010-4-28 23:12

顶楼主
作者: fish_zbw1985    时间: 2010-4-28 23:25

有没有做过AP染色或活细胞染色呢？
作者: 双刀    时间: 2010-4-28 23:50

做的是人的吗？
作者: 双刀    时间: 2010-4-28 23:51

有没有其他照片？怎么大的克隆只有一个？
作者: wangzhuo822001    时间: 2010-4-29 11:04

MEF 处理的丝裂霉素浓度是不是不够？或者是MEF 细胞浓度太大？
作者: wangzhuo822001    时间: 2010-4-29 11:06

还有就是是不是丝裂霉素作用时间不够
作者: anxjs    时间: 2010-4-29 16:53

看你图片，诱导40余日，饲养层居然还有这么高密度，特别是第三张，有点问题啊。MEF处理后还会生长，肯定是丝裂霉素没处理好，我们丝裂霉素浓度为10ug/ml，T25瓶子长满MEF后我们按4ML的液体量MC的，处理2.5h，如果MC配好后很久没有用，最好再摸下时间，可以适当延长30min。克隆多的时候可以挑几个做下AP染色，确认下先。
作者: hansey    时间: 2010-4-30 16:55

你的MEFs还不错，是因为MEFs还在生长的原因吗？
作者: hansey    时间: 2010-4-30 16:56

感觉不是很像iPS克隆
作者: liulilin    时间: 2010-4-30 19:42

感觉不是很像iPS.  丝裂霉素百分之一处理3个小时。
作者: liulilin    时间: 2010-4-30 19:44

一般克隆在感染后15、6天出现 然后越长越大。还有就是iPS的细胞是圆圆的  核大大的。
作者: msliyv    时间: 2010-4-30 21:27

你那些貌似的小克隆像是凋亡的细胞。是不是这些小克隆都表达有导入的基因？另外我猜想你用的不是virus transfection导入方法吧？1 b, g) [% A  D6 |/ i  b

9 Z8 S) {. R& W4 M+ z! R. J回复 1# 小刀
作者: ambassador    时间: 2010-5-1 17:39

另外，ips是不是如昙花一现般的即将谢掉了啊？
6 g. ^& D* l6 _: V* M8 f& B前辈们请高见！7 j: P# _, i' `4 _8 ?8 F9 v9 ~& q
小刀 发表于 2010-4-28 22:50
. M* i- I7 j- O2 ?# Q; g
9 _7 Q9 ~! E0 w
' }$ b7 N+ O0 Y' e. q
    有这方面的担心！我给你看看2010.1.27由斯坦福大学Marius wernig 开发的一种新的细胞编程技术——成体细胞到定向功能细胞的直接转化！这不是跳过了iPS这一步么！！！
作者: raymandd    时间: 2010-5-3 21:41

朋友，# D. i  b( P" ?0 B; ]0 X

* }! A2 z5 D$ G  d/ N  _我只做过病毒转染的yamanaka， 所以只能给你一些有关这个方面的建议。 2 j2 R4 U0 O: r+ H% J( {$ ^# k
病毒制备是最关键的， 你可以浓缩一下病毒，每种病毒病毒原液从30ml浓缩至900ul，每次用100ul/孔(6孔板)，（4种病毒共400ul）， 每孔转染3次。/ _' Q  F& `7 v
! V6 m& M2 \1 Z
你应该可以拿到20个克隆。. j9 J$ n, p. u
+ _: ?4 W9 b+ s
祝好运
作者: Jonathan    时间: 2010-5-6 12:48

回复 1# 小刀 ) D* D/ A6 o, o. E! v$ V0 @8 [
- N# i2 g$ R/ C" ^0 v' u/ h2 d
想问一下LZ，你发的几个图片，一个ips克隆我都没看见。请问你说的“ips”是哪个？
4 A6 M& g2 p% u9 B1 a) e4 q1 t' W# G% ?" ~* q- X$ Q+ ?0 ?
建议一下：加Vc吧。还有VPA，那样你会很快得到ips克隆。
/ |; i8 z0 N) |" u) u/ q. M4 Q4 ^5 h6 m2 {
还有，想说明一下，LZ发帖时，最好说明是人的或是鼠的ips，不然别人难以判断
作者: ambassador    时间: 2010-5-6 14:26

本帖最后由 细胞海洋 于 2010-5-6 14:43 编辑 ' z% C( @: t% o( x- I6 h
有这方面的担心！我给你看看2010.1.27由斯坦福大学Marius wernig 开发的一种新的细胞编程技术—— ..., S. K8 r) {: X, |/ Y9 l, s9 [) j. l
ambassador 发表于 2010-5-1 17:39
7 R$ q: u1 Q! s8 C! a
% p$ K( K6 M' T+ W; b  \# j9 }

% E+ U: n; j+ @, G0 z% q) Y( J" R% g- F& R9 }0 M) y/ [" b
文献已经找到一并分享给大家！
" U& k* y% W# p6 `4 M" z8 UDirect conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors" ?0 v0 k; ~, u+ u+ S9 {
[attach]7361[/attach]
作者: 上官鑫    时间: 2010-9-4 06:25

请问VC或是VPA的浓度是多少啊？是铺到feeder上再加吗？
作者: iseeyou1210    时间: 2010-9-4 16:46

第一个feeder 太少了,第三个是feeder的长势太好了.
8 d# v: o$ k. s这些对ES cell的生长都不好,何况ips细胞.
作者: cicadacjk    时间: 2010-9-7 10:29

1. 根本没看到iPS，无需再养7 c$ r$ p: {6 m
2. 不知道是人是鼠
$ A/ y* q  G. s3. 不知道用什么感染，是否分盘，分了什么密度# f* e- d- |7 D+ r. ~5 T
4. 对照GFP效率如何
作者: 透明微笑    时间: 2010-9-19 19:31

1. 根本没看到iPS，无需再养
3 v& E$ P8 u) C# T! q) U/ n2. 不知道是人是鼠
& {+ `* ^" N; \$ `/ u) F3. 不知道用什么感染，是否分盘，分了什么密度
3 {( M' p9 K, B% e+ \4. 对照G ...( a, l4 X* u* M6 e4 B: |8 i
cicadacjk 发表于 2010-9-7 10:29
作者: gadfly2008    时间: 2010-9-22 00:06

不用四十天啊 为何那么就呢
作者: gadfly2008    时间: 2010-9-22 00:07

我一般两周就可以又到出来了
作者: luohucy    时间: 2010-9-24 21:44

我顶啊！
作者: wangyimei    时间: 2010-11-9 12:38

我个人觉得你那个不是IPS克隆，不知你在诱导之前仔细的看了没有你的饲养层细胞，我认为那是在做MEF饲养层的时候未被完全消化好的MEF细胞团
作者: wangyimei    时间: 2010-11-9 12:40

尤其是第三张很像



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