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标题: 小鼠胚胎成纤维细胞的制备及处理(饲养层) [打印本页]
作者: qgjin    时间: 2010-5-7 04:20     标题: 小鼠胚胎成纤维细胞的制备及处理(饲养层)

本帖最后由 qgjin 于 2010-5-7 04:30 编辑
7 u6 T$ E, @4 R( K6 U
+ f- W& S2 O+ s9 aPREPARATION OF MEF CULTURES
1 v1 P+ F1 M; ^# C6 J1. Remove embryos (E13–E16) from a pregnant mouse, rinse in PBS, remove and discard
: i. j/ N2 m1 v0 @& Z9 l$ qplacenta and fetal membranes, head, liver and heart. Retain and rinse the carcasses in PBS.
  a' u" H; ?1 a' ~2 k5 X! O' [6 U2. Mince the embryonic tissue in 5 ml of trypsin solution, transfer to an Erlenmeyer flask containing a stir bar and a few 5mm glass beads, and stir on( c6 O: j$ [; `% a$ R1 T
magnetic stirrer for 15–25 min (use shorter incubation times if the embryos are E13 and use longer incubation times if the embryos are E16). Ideally,
7 O) {" Q% w# G% Jthe resulting cell suspension should be essentially free of any larger pieces of tissue and should not be too viscous (genomic DNA-lysed cells).
; _9 L3 S! P; g- [3. Pipette the cells with a 2-ml glass pipette to achieve cell suspension. Filter the suspension through a sieve or a screen, add 10 ml of1 [: W2 l  U& N3 j7 h9 B7 o* J
MEF growth medium and centrifuge at 450g for 5 min at RT. Resuspend the pellet in about 3 ml of MEF growth medium.' Z0 c5 V7 L) Z% k6 E( R
MEF growth medium: MEF growth medium DMEM (4.5 g/ liter glucose) supplemented with 15%5 N, Z; L7 s2 Y3 _, [+ ~1 Z
(vol/vol) FBS and 1%penicillin/streptomycin solution for cultivation of MEFs.Store at 4 ℃ for up to 2 weeks.
5 U( [) H0 o, \, @4. Plate the cell suspension onto cell culture plates at a density of about 2*106 cells per 100 mm plate (P0; i.e., passage 0) and incubate in
9 H5 l. [7 w+ [, z  pMEF growth medium at 5% CO2 and 37℃ for 24 h.
, y  Z3 d0 X0 W1 `- Y) l  B, Y0 M5. After 24 h, change the medium to remove debris, erythrocytes and unattached cellular aggregates.5 h+ N$ v/ f) p6 ]! ~
6. Cultivate for an additional 1–2 d until the cells reach B90% confluence.2 L6 w$ t2 Q# _! C# J
7. Rinse the MEF plate with Ca2+- and Mg2+-free PBS twice.6 W* q2 ?+ R4 O- M
8. Add trypsin solution to the culture plates and incubate for 1–2 min.! s/ a, `2 z/ U" Y& a) k
9. Aspirate trypsin solution, collect cells in MEF growth medium and expand them once (1:3 split).
% N: o. n; S: L, e1 p10. Freeze any MEFs not needed immediately.
! a" [; x  U# S# J. K-POINT MEFs at P0 can be stored in liquid nitrogen up to 1 year. 4 U) P4 q% @9 l! L
11. Continue to passage cells as described in Steps 6–9 of this Box. MEFs at passages 2–4 are most suitable as feeder layer for cultivation of0 s3 j# x# E1 Z
undifferentiated maGSCs; prepare as follows.
( b; [( G  M- Z12. Incubate a confluent plate of MEFs with medium containing mitomycin C (10 ug/ ml) at 37 ℃ for 3 h." H; E( w8 q7 K! Z/ d; R
13. Aspirate the mitomycin C solution and wash three times with PBS.
2 S" n8 j2 m' p+ X1 z$ w4 j. R14. Trypsinize MEFs as described in Steps 7–9 of this Box and replate them on new gelatin (0.1%)-treated microwell plates or to Petri dishes
) d4 J) K) _, B& ^3 u% I/ N! E! Aat a density of 50,000–60,000 cells/ cm2.
- Q% }9 z2 O; b0 z( f& W" ~ -CRITICAL STEP MEFs prepared 1 d before maGSC subculture are optimal. Although established cell lines may grow well on 2- to; L8 Y9 ?: W; U0 Q4 O( j2 B8 U
3-d-old MEFs, it is critical to use MEFs within 1 d after mitomycin C treatment for primary cultures (early derivation steps, mechanical! S7 i5 q9 R. u' K1 R3 _1 k4 k
passaging and thawing).
作者: ppcl2    时间: 2010-5-7 09:50

俺感觉这个protocol不咋地哈，有几个人用来自E16胚的MEF来做feeder？
+ Z% n9 j9 }2 J, [. d* }remove and discard placenta and fetal membranes, head, liver and heart.这个也粗放了点哈！/ O, f% }4 ]' B5 E5 g
E16那么多细胞，3ml培养基，不是开玩笑吗？
作者: w1986725    时间: 2010-5-7 10:25

都没有人用胶原酶处理的吗？我想知道胶原酶处理的时间啊！~
作者: ppcl2    时间: 2010-5-7 12:31

回复 3# w1986725
  `% i! p8 w4 H# j) C. P差不多，也是15到20分钟左右。
作者: w1986725    时间: 2010-5-7 13:07

请教一下，是用胶原酶Ⅱ还是Ⅳ？
作者: qgjin    时间: 2010-5-7 16:05

本帖最后由 qgjin 于 2010-5-7 16:21 编辑
' \4 X$ |/ f/ `  Z! K/ J0 Y
俺感觉这个protocol不咋地哈，有几个人用来自E16胚的MEF来做feeder？: d; t4 M) M" N& z
remove and discard placenta and fe ...
0 [; O' i( G% g# wppcl2 发表于 2010-5-7 09:50
) o2 T5 ~/ m/ u" f2 z" O; U( d

1 ]0 Y! v) ^3 w3 X9 \. U* Q只是在论文中搜到的，请讲细一些好吗？（譬如：E？胚最合适？； 取哪个部位的细胞效果更好，怎么取？；终止消化要添加多少培养液？为什么？） 我是新手不太懂 请教一下。
作者: ppcl2    时间: 2010-5-8 01:07

回复 6# qgjin + z  }7 R1 ?$ j+ R3 B
Feeder一般用E12.5或E13.5，最迟不超过E14.5，俺取的MEF都是去头，掐尾，去四肢，内脏全去掉，剩下的躯干剪碎，再0.25%的含EDTA胰酶消化20分左右，加含FBS培养基吹打均匀并停止反应，离心，用吸管小心去除大多上情，再用10多毫升培养基重悬，培养，第二天换液，然后一直养到差不多满了。
作者: majing217    时间: 2011-7-6 16:17

顶楼上，我基本上用13.5天的做饲养层% H! n* S' j  @, `: \- u% \
作者: llecstem    时间: 2011-7-26 14:30

回复 ppcl2 的帖子
. ]: y* C  B# G4 Z) n% C  \8 B3 h. o7 v% c2 a! Z2 u
想问一下，为什么去掉头 内脏 四肢？如果说头和内脏的细胞类型太多，所以要去掉，那四肢呢？谢谢！
作者: hcluo    时间: 2011-7-26 19:21

我个人觉得有一个时间范围，基本都可以使用，但不能太超过。
作者: majing217    时间: 2011-7-28 09:26

我通常取13.5天的，也是去头去尾去内脏去四肢，也是用胰酶消化15分钟左右，然后用含FBS的培养液终止，一般酶与培养液的比例为1:2.之后一只胎鼠接种到一个大皿中。
作者: 褚cell    时间: 2011-8-4 23:11

不知道大哥验证过没啊！建议谁能把做的MEF细胞照片展示一下，这样大家交流一下怎么才能做得好看并纯化MEF细胞。
作者: dongxin    时间: 2011-9-1 15:30

本帖最后由 dongxin 于 2011-9-1 15:31 编辑 . }, R0 l5 h5 b5 y6 i1 N6 u+ ^) ]
  l7 S& y' |$ J
取12.5d—13.5d的小鼠胚胎，将孕鼠断颈处死；取出子宫，将含有胚胎的子宫置于干净的100-mm培养皿中，将子宫用PBS清洗三次，去除血迹；分离胚胎，去掉小鼠的头部、肝部、四肢；剪碎，0.05%胰酶消化；用 MEF培液终止并吹打组织块；用70um滤器过滤；离心，一般1个胚可培养一个35-mm培养皿。供参考，祝好运！
1 k/ X. @  c& f% D2 d
作者: irise1006    时间: 2012-3-9 17:10

ppcl2 发表于 2010-5-8 01:07
6 V7 J. _& [4 B9 j回复 6# qgjin - _/ a# I/ w2 a; j4 B8 v. s. I
Feeder一般用E12.5或E13.5，最迟不超过E14.5，俺取的MEF都是去头，掐尾，去四肢，内脏全去 ...
3 P8 y& f/ u# i7 ~- m
是这样，但胰酶消化时间要根据你买的厂家，这个掌握好，别消化过！
作者: irise1006    时间: 2012-3-9 17:10

13.5较好！
作者: qwch1988    时间: 2012-3-29 22:35

回复 w1986725 的帖子) `- P, S! g! d& c9 T& ]9 c

5 w# ~, H# E( k- V' g好像一般都用胶原酶Ⅳ



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