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标题: MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定 [打印本页]

作者: bypw 时间: 2010-5-10 22:10 标题: MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。
1 v$ c- {$ Y# u) b9 B6 q% n+ D
免疫细胞荧光化学技术的步骤:* d! m! m$ G" ^% p( h
! n- U2 s: z$ r0 A, S) Y0 k
由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。
% `/ j, u( f& S, e/ Z7 K: p. b5 q
1 细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。
PBS洗3次，5min/次.
2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS
洗3次，5min/次.6 e+ o' A! `# ?1 m
3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。
6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.) F% k5 q) |) u2 `7 P
7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，
5min/次.' |/ G+ S6 H9 j1 ]( p( n. s$ c8 E; O
8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。
1 v7 q; @6 g5 [& ^
这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

作者: qingyueqingfeng 时间: 2010-5-10 22:38

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

作者: cm11011 时间: 2010-5-10 22:44

我的步骤和你差不多，但是triton-X我采用0.1%。细胞我采用爬片后鉴定，我觉得这样更节约抗体。对于楼主所说的湿敷，我不明白，可否请楼主说明一下如何操作？还有，4℃过夜后第二天复温益处是什么？

作者: duoduo777001 时间: 2010-5-10 23:14

我做的是脂肪的，步骤跟你有点不一样：
固定，3.5%PFA，30min1 X: M" M0 l9 G Q+ N: Z2 ^( q
透膜，15min RT. m# J- G& h1 L! ?9 W/ I& b/ I
封闭，1%BSA 1h RT dark9 M2 `: s1 G N* N1 J- G
加抗体之前我都洗了的9 o9 D, |; O( k
过夜后，拿出来直接洗，在加2抗。
最后加入DAPI 10ug/ml

作者: Jocelyn 时间: 2010-5-11 08:15

楼主是否需要考虑DAPI复染?

作者: hawkyiger 时间: 2010-5-11 08:47

回复 2# qingyueqingfeng
( W5 h( L& k. ^- ~% u
关于那个防止六孔板干掉，你可以用封口膜或其他东西封一下口，另外再在孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度

作者: lorey 时间: 2010-5-11 10:55

我只做过一次，还没有经验，请教各位几个问题：7 Q4 o( E) T ?' g2 E# |
1、triton-X我们用的是0.3%的，哪个浓度更好呢？
2、DAPI最佳工作浓度是多少啊？
3、我们的结果不是很亮，是因为一抗只孵育了一个小时还是因为二抗不太好呢？
4、有人说wash buffer最好是PBS+1%BSA，不知道有没有道理呢？

作者: duoduo777001 时间: 2010-5-11 11:12

回复 8# lorey . _& ]4 w `" z+ A J
% T9 K/ e5 ?, s7 ~4 D) v" Z- B& h
5 n: y7 Y/ k t, z
wash buffer我一直都是用的1XPBS，DAPI用的是10ug/ml，做过孵育一个小时的，也做过过夜的，个人觉得过夜的效果好一点，但是理论上是两个都可以。另外我们DAPI洗过之后，会在用mounting solution固定。避光4°条件可以保存一个月。

作者: yxp 时间: 2010-5-11 14:09

弱问，激光共聚焦可以看孔板么？+ _6 w, N5 s- }8 [" J, k5 }
/ k% d& y9 b A/ W. E$ k# D$ S5 Q
我一直被告知不能看.....汗

作者: bypw 时间: 2010-5-11 18:26

回答网友提问： ; K1 y' v" o' w2 t! z+ R: r; m
  DAPI用的是10ug/ml 复染最后一步加入，
  激光共聚焦是可以看的可以看孔板。
  为防止六孔板干掉，我是在周围没有用的孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度。7 ~4 F" h; _8 H" I6 J5 b" S5 B* l  [
第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）  这一步也主要是复温主要为了在下一步加抗体时能发挥更好的作用，  超过30min需湿敷主要是防止干燥，主要是在的孔与孔的间隙里加点蒸馏水。: G4 {+ e8 W. F: |+ d
  这是我的回答，不对之处请战友们帮忙优化，谢谢，看了的帮帮点一点上面的  ”顶“。支持一下。

作者: qingyueqingfeng 时间: 2010-5-11 19:52

回复 7# hawkyiger " c0 i0 e: L9 h3 I
( G4 G. y9 ^; r( s. M) B* }% e4 `
谢谢，学习了，这是我一直以来的疑问

作者: lorey 时间: 2010-5-12 14:04

回复 9# duoduo777001
0 m+ o1 E) s" g9 M

呵呵，谢谢答复

作者: fish619 时间: 2010-5-12 15:50

六孔板好像太厚了，好像不能在荧光显微镜下看吧，我一般是在六孔板里放入盖玻片后爬片后再做免疫荧光，固定后粘到载玻片上

作者: bypw 时间: 2010-5-12 15:55

回复 14# fish619 ( R# {. P9 b- A- f; l% M1 N) A

7 l w) P8 _% i* O ^* e
没有问题，可以看的

作者: duoduo777001 时间: 2010-5-13 17:25

回复 1# bypw
5 q7 u" U t3 x" ]; v
/ E& B6 D" T. g& a
请问是不是一定要湿敷

作者: yanxuebo1979 时间: 2010-5-13 21:20

免疫荧光标准详细步骤：/ _; }0 y( E: h( N7 T
) Q- p- z. L; v) c3 |* ]
①各组细胞以1×l05/L的细胞密度接种于6孔板中的爬片上，待细胞生长至70%融合时取出爬片。1 t5 z3 O% T% Q8 m) |. S
②4℃丙酮固定爬片20min，0.0lmol/L的PBS(pH7.4)洗涤细胞爬片3min，2次。" \) r/ e9 W2 K2 ]
③滴加封闭液，室温20min，PBS振洗，3min，2次。
④0.1%的Triton-X100孵育10min后，增强膜的通透性，PBS振洗，5min，4次。( D: |& Q5 H7 ^: j9 z
⑤滴加鼠抗一抗工作液，37℃孵育1h，PBS振洗，3min，3次。* l8 N$ C+ r( ~. S1 {$ w. _" u
⑥滴加生物素标记的羊抗鼠IgG，室温20min，PBS振洗，3min，3次。* F& @4 @% v+ w+ y
⑦滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SACB)，室温20min，PBS振洗，smin，4次。
⑧滴加DAB显色剂30min，自来水冲洗。
⑨苏木素复染30s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。$ y$ p `" g7 y
⑩荧光显微镜观察，拍照。

作者: bypw 时间: 2010-5-15 09:52

回复 16# duoduo777001
" _) K; q8 |# j- B2 F6 u. S B
不一定，你可以先做做看看啊

作者: dingyx2009 时间: 2010-5-28 00:18

回复 17# yanxuebo1979

( U" X- O" a8 Q; C A- q0 G" k
回复yanxuebo1979：
两种方法都可以的。你说的是三步法，楼上的是两步法，更方便简单。我们实验室都用两步法。结果很好。只是略有不同，细胞固定我们多用30分钟，以防后面洗脱掉。入trition-X后，可以不洗，直接加一抗。至于湿敷，最简便的就是放入湿盒中，肯定不会干。自制湿盒，可以取一能放板子的饭盒，在饭盒的底部放上湿的纱布，在放上板子，盖好饭盒即可。

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