MSCS诱导分化后的免疫细胞化学鉴定

bypw

前几天将诱导后的MSCS做了RT-PCR鉴定相关基因的表达情况，证明诱导可能成功了。接着实验应该要进行相关蛋白质的鉴定，我打算做免疫细胞荧光化学检测相关的蛋白表达，找了很久也没有找到一个详细的步骤，看了很多网站以后，总结出了其步骤，跟战友们分享，后天准备按照这个步骤做实验，大家也看看有什么问题没有.一起讨论一下。! s; `' Q1 y" b

" c# z5 w2 o0 O* X6 T0 i免疫细胞荧光化学技术的步骤:
( i5 i$ I, T: h& U
3 O& y4 y, U1 k   由于我对MSCS诱导时间比较长，是在6孔板上进行的，所以我就直接在六孔板上进行操作，不做细胞爬片。- \- z! [; }5 A; o" p' x- v* T; W
7 q8 Y5 H% j/ h; s( r
1   细胞固定。用合适的有机溶剂如4%的多聚甲醛固定10min,室温。8 J4 V: P7 z! i! s4 P
PBS洗3次 ，5min/次.+ V! T$ }/ E1 `; J$ Z
2. 透膜。用0.2triton X-100，室温，10min.PBS4 j( {; ~8 L2 F/ v
洗3次，5min/次.
  M5 I2 }9 Q, P1 R  ]0 q' c# \3. 封闭抗原。用与二抗来源相同的同种血清（我的2抗是羊抗兔的，所以我选的是羊血清）。37℃，30min.孵育后不要洗（洗就没有封闭抗原的作用了）。  m. T  N( K4 f+ D+ m
6. 加入一定（或一定范围）抗体滴度的一抗，4℃过夜，第二天复温37℃，60min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，5min/次.7 o4 B5 \+ |/ O
7. 加入荧光标记的二抗，37℃，30min湿敷（超过30min需湿敷）。PBS洗3次，
$ i0 e* p  o6 ]. e: @5min/次.
' m1 q$ r" g! O+ L! p+ \8. ，直接在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察）观察。$ S2 C  k6 F& H/ l1 U

) G1 k. t/ Z6 Z8 T) O这就是我打算用来做免疫细胞荧光化学技术的步骤，大家觉得有什么要修改的没有，指正一下

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

qingyueqingfeng

我用固定30min，还有想请教一下你敷一抗后4度过夜，怎么保证六孔板不干？还有为什么要复温，直接下一步不可以吗

cm11011

我的步骤和你差不多，但是triton-X我采用0.1%。细胞我采用爬片后鉴定，我觉得这样更节约抗体。对于楼主所说的湿敷，我不明白，可否请楼主说明一下如何操作？还有，4℃过夜后第二天复温益处是什么？

duoduo777001

我做的是脂肪的，步骤跟你有点不一样：% B+ z# M% B. n, r
固定，3.5%PFA，30min
9 M2 R& |, B' y5 x$ q: f透膜，15min RT
2 h  Q$ P; F7 [" \  ~" b封闭，1%BSA 1h RT dark5 G$ z' f4 l$ P- ]& s; y5 J0 i/ W
加抗体之前我都洗了的
' x9 B7 ~  X" z过夜后，拿出来直接洗，在加2抗。
% z* }" R! p+ r" G* ?( p7 I最后加入DAPI 10ug/ml

Jocelyn

楼主是否需要考虑DAPI复染?

hawkyiger

回复 2# qingyueqingfeng
3 m& W/ b! W" k& l, T' I
% w2 c0 r. B  Z关于那个防止六孔板干掉，你可以用封口膜或其他东西封一下口，另外再在孔与孔的间隙里加点蒸馏水，保持一下湿度

lorey

我只做过一次，还没有经验，请教各位几个问题：
7 q+ Y8 B7 Q8 _; i! N0 v1、triton-X我们用的是0.3%的，哪个浓度更好呢？' b9 W5 e! `9 e3 n, u! F
2、DAPI最佳工作浓度是多少啊？) }1 g& c$ O- j
3、我们的结果不是很亮，是因为一抗只孵育了一个小时还是因为二抗不太好呢？7 R0 f# l$ Y; C$ C% o
4、有人说wash buffer最好是PBS+1%BSA，不知道有没有道理呢？

duoduo777001

回复 8# lorey
: v  J" u) B5 \$ u  h1 Q$ _1 ~* ]+ I$ b! v% M
- {6 T4 r$ N6 B2 w9 P. Q) Y) W; n
    wash buffer我一直都是用的1XPBS，DAPI用的是10ug/ml，做过孵育一个小时的，也做过过夜的，个人觉得过夜的效果好一点，但是理论上是两个都可以。另外我们DAPI洗过之后，会在用mounting solution固定。避光4°条件可以保存一个月。

yxp

弱问，激光共聚焦可以看孔板么？
' b( \' f# O: R/ y' T
& R6 a) ?: i$ M" W+ R我一直被告知不能看.....汗