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标题: feeder cell 消化问题成团下来 [打印本页]

作者: youyou315 时间: 2010-5-21 19:23 标题: feeder cell 消化问题成团下来

请教各位战友，我最近铺的小鼠滋养层细胞在干细胞传代消化时总是成团状的掉下来，37度3－5min消化之后滋养层细胞总是成絮状，吹打不开，不知道是什么原因？板子是用0.1％gelatin 处理过的。

作者: starlight 时间: 2010-5-21 21:52

应该不会这样的，我养的是小鼠胚胎干细胞，ICR小鼠MEF做的饲养层，用的胰酶浓度是0.125%，消化大概1-2分钟，滋养层细胞基本变圆，干细胞克隆内部每个细胞也边界清晰了。。

作者: jiejesse 时间: 2010-5-21 22:49

你的那个絮状的可能不是饲养层，我曾经看过gelatin在传代是就会像絮状的东西一样下来，just leave it alone，不用管它，但是也不要拿这种东西去传代啦。你用吸头把它挑到培养皿的上面没有液的地方就好了。

作者: tangxiao 时间: 2010-5-21 23:57

我做过feeder cells（emf cells）先后做过多次，参考了几个protocol，但我经验总结：
1.取13.5-15.5d 的孕鼠胚胎都可，去头、四肢、内脏，剪成约1cm3大小，试管内pbs清洗，自然沉淀几分钟，吸出上清，取块状组织于15ml试管内，加约10ml0.25%胰酶，置于细胞温箱内20-30分钟；" y5 f0 k$ s! ~: B
2.取出可见组织块和絮状物，吹打，组织块会消散，但絮状物会存在，絮状物里含有大量成纤维细胞，反复吹打，直到絮状物明显减少，加dmem中和；
3.离心，速度可以2500-3000rpm/mim，才能把细胞沉淀，可以再形成絮状物，可以肯定的说emf cells就在这里面，小心吸去上清（注意，不要倾倒，因为絮状物很容易倒掉），保留絮状物或将其转移到另一个试管；加emf培养基，再反复吹打直絮状物消失，（建议少量多次加培养基，更容易吹散）；
4.计数，分瓶；次日换培养基，可加pbs洗去细胞粹片；/ d5 p/ k: a, V3 P) H2 K
5.第三天可冻存，建议等细胞90%以上融合后再冻存，因为状态好的emf细胞伸展很好，消化后，看起来细胞数量明显减少，不利于冻存。
以上是本人做的emf细胞，肯定有不完善或者不很标准的地方，望有经验者交流。

作者: xjya 时间: 2010-5-22 22:41

检查一下你使用的胰酶活性是不是有问题，一般0.05%的胰酶消化1-2min就差不多了。胰酶最好是不要反复冻存解冻，分装成5ml左右，4度下一周内用完。

作者: xjya 时间: 2010-5-22 22:49

回复 4# tangxiao / i' t4 Z3 Y, b
# O0 Y! p/ ^: W* }" u

补充，你这个絮状物跟楼主提到的絮状物有区别。在原代培养过程中，用酶消化的方法从组织上消化细胞的过程中，组织逐渐变疏松，呈絮状，很正常。楼主的问题是干细胞传代过程中出现的大片细胞团絮状物，可能与酶的活性不够有关。

作者: tangxiao 时间: 2010-5-22 23:12

回复 6# xjya ; k; [% O# D/ J! B

1 [& C; C. q' R7 X$ G3 S
你好！0.25%胰酶没有问题，有protocol的做法是胰酶加10ml，孵育10-15min，吸出5ml，并补充5ml胰酶，再孵育10-15ml；吸出的消化液悬液加dmem中和；如此反复3次左右。我总结，一次直接孵育20-25分钟，也能达到相同的效果，而且操作的次数少些，污染的机会更少！
传代过程中，离心后emf cells也会呈现絮状，也需要如上法尽量吹散。

作者: xjya 时间: 2010-5-22 23:22

回复 7# tangxiao - Z2 j* ^# o+ j

2 F9 k+ w4 v* X
hehe,没说你的方法有问题，你的protocol很好，我是说你们两说得不是一回事儿，你的是获得滋养层细胞的方法，楼主的问题是干细胞传代中的问题。我说的“一般”是我用0.05%的胰酶消化1-2min就可以了，仅供楼主参考。0.25%胰酶消化干细胞10min对干细胞有损伤。

作者: youyou315 时间: 2010-5-24 18:57

感谢大家的热心讨论和帮助，我仔细观察了消化下来的细胞团，现在认为可能是gelatin的问题，因为感觉消化的时候gelatin也整块脱离下来，在显微镜下观察了一下，上面粘附了很多细胞。我一般铺gelatin 是37度 5-10min, 或者室温 20－30min，是不是gelatin作用时间的问题？

作者: afei198520 时间: 2010-5-28 10:25

回复 8# xjya
" N' T; M. b y, z
赞同，我们也是用的0.05%的胰酶，效果也很好

作者: xjya 时间: 2010-5-28 15:08

回复 9# youyou315
7 {, c/ A" {; l. M# }* Y
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1% gelatin 4度过夜或37度培养箱内2小时

作者: xjya 时间: 2010-5-28 15:12

回复 9# youyou315 / l" y; f' g: t% P: D, R; P$ p
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打错了,是0.1%gelatin。还有铺盘的时候要混匀gelatin溶液，种细胞前将gelatin吸干。不过你说的问题之前我没有遇到过，只是提供信息供你参考

作者: ruofan1982 时间: 2010-6-4 10:46

我是0.1%gelatin包被10分钟就可以用了

作者: 大猪小猪落玉盘 时间: 2010-6-4 16:31

那种东西到底是什么细胞分泌的？什么成分？本人在传代过程中也经常遇到。

作者: esc123esc 时间: 2010-6-8 17:52

我也是出现一样的情况，消化下来的都是成团的MEF，吹不散，不能形成单细胞，有时候连在一起絮状的一片片的吹不散，不知道怎么办，传下去之后局部会一大团，很头疼这个问题啊，我用的也是0.05%的胰酶啊，自己配的，不知道是不是自己配的胰酶有问题啊，大家都用的是买的成品吗，还是自己配的啊胰酶

作者: exin11 时间: 2010-6-8 18:16

其实有时会成团，吹打不开的～你要看细胞状态而定。传代时，稍微的稀一些（可也别太稀，那样长不好），一代的时间，以293T细胞看约为两天，就得传，时间长后，会成簇，非常不好吹散～～' w7 M, L/ Z4 y/ n u2 c
还有就是成簇可能是因为你的酶活性不好，酶不要反复的温度变化，那样就不好准确计算其中的浓度，这样影响消化结果～～

作者: dilal 时间: 2011-8-2 12:30

我也遇到了楼主的问题，消化时大片的膜状物脱落了下来，感觉像是MEF分泌的一层膜样的东西。消化时不能过度晃动细胞瓶，最好不要拍打细胞瓶，这样就很容易形成絮状物。但是我们消化明胶铺板的MEF时，就没有出现这种问题，也不知道是什么原因。最好是让胰酶消化时间足够，使细胞自己悬起来比较好。

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