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标题: 请教如何设计引物，以便用PCR的方法检测外源基因的表达 [打印本页]

作者: runsong 时间: 2010-5-24 20:11 标题: 请教如何设计引物，以便用PCR的方法检测外源基因的表达

我将一个基因用慢病毒载pMSCV体转染细胞，现在想设计一引物检测此外源基因的表达。要遵从何原则，望前辈不吝赐教。

作者: POPOLD 时间: 2010-5-25 12:13

表达？

作者: 绿雪 时间: 2010-6-11 11:23

是RT-PCR检测mRNA水平的表达吗？根据你的基因序列设计特异性引物就可以了。

作者: hndxws 时间: 2010-6-11 13:04

同意楼上的意见，应该是用做于RT的，拿未转染的作对照。如果有这个表达产物的抗体，就直接时间梯度收样，做western，这样比较直接。

作者: 念想儿 时间: 2010-6-21 16:17

一般的操作都是转染之后的细胞单克隆化吧，之后再设计引物RT-PCR检测以及48h后收细胞做western吧

作者: zhanghuabing11 时间: 2010-7-9 17:02

我们构建的转基因载体在体外检测不到目标蛋白表达，是怎么回事？做转基因动物需要在体外进行检测吗？谢谢！

作者: 绿雪 时间: 2010-7-9 20:03

回复 6# zhanghuabing11

检测不到目标蛋白的表达？用什么方法检测的呢？在什么宿主表达呢？确认阅读框正确吗？
能否把问题说得明白点，大家才能给些建议啊。

作者: shihuijunm 时间: 2010-8-14 08:47

实时监测量的多少，最好用实时荧光定量PCR，设计引物可以在网上收索到

作者: xiangchou812 时间: 2011-5-14 14:11

一般都是先做RT-PCR来检测mRNA有无，然后去做免疫荧光或western检测蛋白表达。

作者: POPOLD 时间: 2011-5-21 23:43

流式定量免疫组化 western walking southern

作者: xiangchou812 时间: 2011-5-23 23:00

还是以你的目的基因为模板，设计引物，先鉴定一下筛选的克隆里有无目的基因整合。# v8 ?# e3 o. s. u) ]$ W1 X9 ]( R
然后以目的基因cDNA为模板，在设计一对引物，提取总RNA反转录检测目的基因表达与否。

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