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标题: iPS诱导过程中感染效率很低的问题（附图） [打印本页]

作者: jason 时间: 2010-5-28 09:01 标题: iPS诱导过程中感染效率很低的问题（附图）

本帖最后由细胞海洋于 2010-5-28 10:09 编辑

我用pMX-GFP载体转染Plat E后荧光表达还是很强的，但是48小时候收病毒感染MEF细胞却看不到荧光，或者荧光很弱。开始以为是plat E或者polybrene的问题，后来将这些都换了一批新的，但仍然效果不好。请大家帮忙分析一下到底什么原因导致感染效率低下。附上两张图片：转染后24h的plat E和感染后72h的MEF.- \' ^* z" w, T( K+ y& f3 h. n
[attach]8412[/attach]" S+ P: H- E4 I3 h* r' u3 W
[attach]8413[/attach]

作者: liulilin 时间: 2010-5-28 09:21

关于提高转染感染效率问题请看下面这篇文献

作者: lingren 时间: 2010-5-28 10:06

对照与目的基因载体肯定会有差别啊，看你载体是怎么构建的，GFP发光说明载体序列没遗码，是正确的，另外，你是将四个基因构建在一个载体上了？载体过大当然会影响效率，慢病毒就存在这个问题，逆转录病毒应该也是这样，建议四个分别包装！7 N v1 k. j0 k: y) ^+ V, ] C/ O# |3 d
滴度问题你也没有提及，在细胞可承受范围内提高滴度嘛！楼主自己要先分析，再把问题写详细！

作者: jason 时间: 2010-5-28 10:32

病毒滴度我没测，我是直接收集上清感染mef细胞。我就觉得奇怪，为什么转染效率还可以而感染很差，如果真是病毒滴度太低，那么包装环节出什么问题了吗？我是按protocol标准操作啊！ {* p3 E: ~7 c- L
pMX-GFP在这里只是做一个阳性对照，观察转染和感染过程有没有问题。对于那四个因子，是分别包装的。现在对照都有问题，四因子感染当然没法做。

作者: 上海过客 时间: 2010-5-28 11:20

换个 293T 细胞试试？容易感染的试试？
+ a/ C, S+ M; [0 A8 A! x& }& J
说不定是 MEF的问题？ MEF 是第几代的？有没有测支原体是否污染？

作者: 饶冠华 时间: 2010-5-28 14:12

有没有明场照片？计算过感染比例吗？看下面那张照片里还是有蛮多细胞感染上GFP了啊只不过表达不是很强。包装可能没什么问题，可能跟靶细胞有关系。另外楼上说的用293T做靶细胞去试试是不可行的，因为293T是属于人源的，而plat-e包装出来的病毒不能感染人源的细胞，一般只针对鼠源细胞

作者: 大刀无敌 时间: 2010-5-28 16:42

你病毒是怎么用的原液还是浓缩液感染细胞数量怎么样感染后几天发的照片

作者: 上海过客 时间: 2010-5-28 22:01

有没有明场照片？计算过感染比例吗？看下面那张照片里还是有蛮多细胞感染上GFP了啊只不过表达不是很强。包 ...4 m! ^. Z) y* Q* R; K; G4 n6 G
饶冠华发表于 2010-5-28 14:12

; d+ V* i" F( D$ @ j" p$ [
能否确认？好像 PLAT-E 就是从293T细胞得到的

作者: 饶冠华 时间: 2010-5-29 15:38

回复 8# 上海过客 ! [- a% B w" j" }1 a }# c
1 g M/ _0 \' j/ B5 |& s
逆转录病毒包装细胞系：单嗜性（Ecotropic）Plat-E包装细胞系、双嗜性（Amphotropic）Plat-A包装细胞系及泛嗜性（Pantropic）Plat-GP包装细胞系。它们对不同的细胞具有不同的侵染性。* N" n: I) |/ ^/ x0 K$ ~' M+ P

Plat-E包装细胞系（Ecotropic）是一种来源于人胚肾(Human Embryonic Kidney, HEK)293细胞系,主要用于快速、短暂地产生高滴度逆转录病毒，同时也能用于稳定地产生逆转录病毒。由Plat-E包装细胞系产生的病毒表达一种单嗜性的被膜，因而只能感染小鼠和大鼠细胞。Plat-A包装细胞系（Amphotropic）也是一种来源于HEK293细胞的细胞，在将病毒env 基因导入该细胞时利用嘌呤霉素作为选择标记，因而对于一些使用嘌呤霉素作为筛选标记的载体无法使用。Plat-GP包装细胞系（Pantropic）也来源于HEK293，但却是一种泛嗜性的包装细胞系，其包装产生的逆转录病毒颗粒既能感染哺乳动物细胞，也能感染非哺乳动物细胞。在使用过程中, Plat-GP细胞需要用逆转录病毒载体和pVSV-G来共转染。VSV-G是泡状口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus) 的被膜糖蛋白，能通过脂质结合及质膜融合来介导病毒进入细胞。因此在使用Plat-GP细胞系时，还需要额外的使用pVSV-G完成包装。

作者: xyzengh 时间: 2010-5-29 22:38

从MEF的感染情况来看，效率并不低，应该足以用于重编程，另外反复感染有利于提高高燃效率，丁香园上有两个帖子也许有些经验值得你借鉴，祝好运。: t f3 ?6 |: U. ? c0 I
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=76&id=17082882&sty=1
http://stemcell.dxy.cn/bbs/post/ ... amp;tpg=3&age=0

作者: 上海过客 时间: 2010-5-30 19:23

谢谢 9楼的回答。

作者: ahfjwangrui 时间: 2010-7-3 11:51

不知道楼主能不能告诉我一下你是用什么转染试剂包转病毒的

作者: dabai22222 时间: 2010-7-10 23:11

建议梯度测下滴度，这样才好说

作者: 双刀 时间: 2010-7-16 10:59

我觉得应该是MEF细胞状态不好引起的。从照片看，转然效率挺高的，包装应该没问题。还有，楼主在感染时用的病毒量是多少？每因子750ul吗？楼主可以尝试增加感染时的病毒量。楼主是哪个地方的？

作者: Helena110 时间: 2010-7-16 19:47

我也有这方面的苦恼不知道怎么把病毒包装好提高效率

作者: 大笨鸟 时间: 2010-10-9 12:25

从第二张照片看，效率还好啊，是可以用于重编程的。我也请教了高手，他说这样没有问题，可以继续往下做。

作者: 大笨鸟 时间: 2010-10-9 12:26

想问下楼主是那个实验室的？

作者: 飞舞的冬季 时间: 2012-8-8 16:25

初学者，学一下

作者: huangcong1988 时间: 2012-8-8 21:51

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求plat-e细胞，我的QQ：649441514，万分感谢！

作者: huangcong1988 时间: 2012-8-8 21:52

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求plat-e细胞，qq：649441514

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