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标题: 原代细胞冻存技术 [打印本页]

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作者: aehxing    时间: 2010-6-5 13:45     标题: 原代细胞冻存技术

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- {3 g! `: ?* d" }% \2 @& r原代细胞冻存技术
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这觉得这个归纳的还比较简单。是从一个网上站上看到的，里面还有其他相关技术。
1 \9 D4 L8 i) t; s1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。. P! J9 k! Y' [2 U! j% z
2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。8 g: x4 O8 n8 I% z% v9 s
3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。  W# _8 Y9 O- w5 S
4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）×106/ml。+ X6 W1 s1 B6 E
5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
5 e4 x( D; c# M6 \8 E6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6 V# h3 d% N: b! |# O! }
7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。
7 m5 F3 r, t# Q9 r0 t5 _8、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（－80℃过夜）→液氮。

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作者: bigbiggirl    时间: 2010-6-5 15:26

最好用冻存盒，我们实验室有，加上异丙醇，就直接放-80度就可以了，说是保证每分钟降一度。是个好东西

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作者: morning860    时间: 2010-7-11 09:49

但是书上也有说封口不能太紧，否则也很容易爆裂的~~

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作者: youyou0795    时间: 2010-7-13 15:23

怎么看起来和普通的细胞株冻存技术一样？ 我们冻存细胞买的Corning的冻存管，质量很好，从来没有爆裂的情况

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作者: deron    时间: 2010-7-14 15:38

推荐一种更加简单省时的冻存方法——不知道大家有没有试过直接加入4℃预冷过的冻存液混匀细胞，然后迅速冻到-80℃。节约很多时间，冻存液是由10%DMSO加90%含血清培养基配制而成，如细胞珍贵可适量增加血清含量。复苏时用台盼蓝染色检验，成活率在95%以上。

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作者: ouyi2738    时间: 2010-7-16 08:24

回复 5# deron
/ C$ M7 l, A" O& H* X& d; {& _: O; n* |这个真没试过，有意思，回去试一下。我们冻存盒都被占了的时候，就直接包棉花，裹上一层棉花，直接扔-80里。好的管还是拧紧一点吧，液氮近不去，当然不会爆。另外我觉得Corning反倒是爱爆的，我们实验室订的外旋的Corning我都不用，自己订的cellstar的这个管是从来没爆过

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作者: deron    时间: 2010-7-16 17:29

回复 6# ouyi2738
/ L) B( @1 I5 r5 s5 t我们的Corning从来没爆过，内外旋的都挺好用。至于没冻存盒了，解决办法很多的，我们通常用血清瓶子，培养基瓶子等等等等直接把管子扔进去。如果放液氮的话我们会用纱布棉线打个中药包造型然后吊进罐子。

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作者: tuzi8780238    时间: 2010-7-16 17:59

我觉得有个办法挺好的，就是用棉花将要冻存的严严实实的包裹起来，然后直接放进-80度过夜，再转入液氮，这舍了一步步降温麻烦了（我们实验室一师兄发明的，屡试不爽）。

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作者: dilal    时间: 2010-7-17 00:35

国外有些知名的干细胞研究所推荐的干细胞培养指南中提到：在加冻存液时需要一滴滴加入，以防止细胞受损，但我看我们实验室的都是直接加入的。冻存液的加入方式对细胞生长真的有影响吗？

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作者: deron    时间: 2010-7-17 08:39

回复 9# dilal ' o8 n9 N4 h: D1 z9 k9 q; X

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  x) q, t+ b. O/ v5 V  g9 ^    我们都是直接加的，没有影响，也许某些特殊的细胞需要特殊的处理吧，不知道他们这么做的原理是什么呢？
) x: N  _0 ?! g& U2 @7 y! ~9 f   另外，我们配制10%DMSO的时候倒是需要把DMSO一点点加入预冷的培养液中，而不能反之——正如稀释浓硫酸的时候只能将浓硫酸一点点加入水中一样，因为这两个稀释过程都能大量产热。

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作者: morning860    时间: 2010-7-20 22:21

回复 10# deron
+ r. P. @3 ?! w6 a4 p7 z3 _. m4 [
" i( `, ]$ H0 r: d+ r% e
    如果不像你们一样对培养液进行预冷，而只是等所有的成分都加到一起后按温度梯度降温，那么是否加入DMSO和培养基血清的顺序就不用那么在意了呢？

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作者: deron    时间: 2010-7-21 14:50

回复 11# morning860
" O$ O- q' X6 ?" Q, |& W7 _: Y
6 n5 d* d( ?) f1 N4 g; X' W5 e: r! q+ M  V
    即使用程控降温仪，初始温度也不应高于10摄氏度。DMSO在常温下对细胞活性影响很大。而稀释DMSO的步骤本身就是一个大量放热的过程，所以建议先配好冻存液，4摄氏度保存。现用现加

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作者: morning860    时间: 2010-7-21 22:40

回复 12# deron ( m3 W+ S! I9 |; ?, c+ u' k1 r

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6 }/ }) V1 N7 `# T3 [    我们做的时候是把DMSO与血清1：4加到每个冻存管，然后再加等份的培养基细胞悬浮液，每个冻存管里加的液体总体积为1ml，体积比较少散热应该快些，但是也是在室温下操作的。。。不知道会不会有影响，刚冻了不久。。

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作者: deron    时间: 2010-7-22 08:33

回复 13# morning860 3 Z/ Q  m$ {+ j  t# G
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* A9 b5 X: f! {5 b6 M+ x
    据说DMSO在十几度的时候对细胞的毒作用很大，不过我们没有试过成活率。猜测影响会有一些，但不大。- \% |. {; ]1 e" m
   记得是先加入血清，再加入DMSO即可。我经历过一次把血清往DMSO中加，结果整管液体立马变成棕灰色——我想是血清中的蛋白热变性了

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作者: morning860    时间: 2010-7-22 09:51

回复 14# deron ' w) F/ `& j+ d. s0 @# n5 |! [# o

) g$ g$ d: m1 I# Z
  S* o$ I6 _, z7 m0 v7 `- x8 }    成活率等到时我复苏的时候就知道了，至于加的顺序以前真没在意，但我特意看了下冻存管里液体的颜色，我记得是正常的，希望不要杯具了。。。

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作者: afei198520    时间: 2010-7-22 12:19

DMSO只要控制在一定浓度以下就不会对细胞造成损伤了。. z% N5 I) \5 I+ E' L4 k8 P; p  S
冻存管爆裂的事情我们实验室还真的从来没有发生过呢。

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作者: 277951986    时间: 2010-7-24 10:39

我们实验室都是用DMSO:血清：培养基=2:1:7，混匀后，直接用棉花包住，再装进一次性手套的手指里面，直接放-80度，过夜后就可放入液氮内。比从4度到-20度再到-80度冻的细胞活性药好很多。

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作者: show0ji3    时间: 2010-7-24 15:36

个人认为，最好别用内旋的，容易爆瓶，另一个容易在解冻的时候污染。

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作者: qzx_everything    时间: 2010-8-29 21:09

谢谢啦

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