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标题: 神经球传代问题？？ [打印本页]

作者: lujn100 时间: 2010-6-9 10:53 标题: 神经球传代问题？？

我的原代神经球好不容易养出来了，但传代总出问题，总吹不成单细胞，我的protocol基本如下：收集细胞培养液，1000r/min离心2-3min富集神经球，弃上清，加入tryple（胰酶的替代物，之前Nature protocol上提到过）37度消化7min，机械吹打60下左右，1ml和200ul的枪头都试过了，镜检看还是没吹散，后来用1ml注射器又吹打几十下，好不容易吹散了，接种后好多细胞都不聚球了，估计是损伤太大挂掉了，各位有没有好的传代方法啊？谢了~

作者: wgydys 时间: 2010-6-9 12:13

1.加入tryple前用PBS洗三次。
2.细胞细胞打不散，可在tryple中加入2%EDTA,应该可以打散细胞，不要强力吹打。

作者: zsc78 时间: 2010-6-9 20:15

同意楼上意见：首先你没有用PBS或HBSS漂洗，培养液或血清中和胰酶的部分活性；个人经验好像胰酶+EDTA的消化液的消化能力比tryple强，tryple好像相对温和些。

作者: lujn100 时间: 2010-6-10 10:45

回复 3# zsc78 # T( D, d( r) H7 Y/ M; ?
* h1 ?: f" l* c! N' j8 Z. i0 c
8 |; M8 |6 g8 U9 s
谢谢哦~! A B; J1 i& H4 ?! @
我的培养基里是不加血清的，用你的方法大概需要消化多长时间呢？我用普通胰酶接种原代细胞时消化5min，发现细胞基本都贴壁了，分化出好多小胶质，是不是消化太厉害了，所以我现在都不敢用普通胰酶了....

作者: lujn100 时间: 2010-6-10 10:48

回复 2# wgydys
5 d2 ^6 H1 B( s, s$ \. U7 u' {

用pbs反复洗，会不会对细胞损伤太大啊？而且我的培养基里都没有血清的，你在传代的时候一般吹多少下可以吹散啊？

作者: wgydys 时间: 2010-6-10 11:13

消化时间长短需要根据镜下观察决定，只要细胞间连接带明显可见和粗大即可，每种细胞的消化时间不一样。

作者: get0715 时间: 2010-6-10 13:40

回复 6# wgydys ; S& l( n- Y/ A: F

神经球不是贴壁细胞，看不见消化程度。如果细胞有突起贴壁，细胞很可能就已经分化了。

作者: get0715 时间: 2010-6-10 13:43

神经球的传代问题确实不太好解决，你根据自己的实验做一组消化时间的梯度实验吧，相同多的细胞，加入相同浓度的酶消化，1分钟为梯度，看哪种最容易消化为单细胞，并且活性好不容易贴壁分化。

作者: guojingjing 时间: 2010-6-18 15:19

回复 4# lujn100 - f+ n( d# P% `6 ?

神经干细胞还能分化出小胶质细胞？小胶质细胞不是起源于骨髓吗？在发育过程中从外周进入脑内的

作者: luckydog 时间: 2010-11-25 12:58

用0.025%的胰酶-EDTA消化神经球

作者: angelyannan 时间: 2010-12-2 09:45

觉得离心转速有点大了，建议在你收集细胞悬液后静止收集神经球，或者500rpm离心2-3分钟收集。tryple消化4-5分钟即可，容纳后1000枪头吹打即可打散。

作者: angelyannan 时间: 2010-12-2 09:45

然后1000枪头吹打即可打散。

作者: smkx 时间: 2010-12-2 13:31

神经球的消化难易和物种及年龄关系挺大的。同样的方法，tryple消化胎鼠神经球37℃，5min,吹到40次左右即可。但成体猪的需要反复消化3次才可以成为单细胞。我一般是离心800r/3min。

作者: SVZ 时间: 2010-12-28 13:38

神经球的传代牵涉到的问题很多，你是做胎鼠吗？神经球培养的密度是多少？传代时神经球的大小？我是做胎鼠神经干细胞培养的，用的也是Ttryple，消化时间5-10min。用玻璃滴管或者进口1ml枪头很快就能吹打开。但是如果神经球培养时间过长，直径过大，就会和你说的一样，增加n多吹打次数也会有部分神经球顽固不化。所以建议你留意一下你传代时神经球的大小。

作者: dingyx2009 时间: 2010-12-30 01:48

再温和的消化酶，在其中反复吹打60次，对细胞损伤太大。就你的操作，可不可以这样改良一下：( t) n6 ?, s4 N3 M: I/ s# {, Y
1.枪头容易污染，用弯头的滴管，在火上烧，保持其口径小，圆，滑（吹打有力，不刮伤组织）。; c: V- `, P" k7 l$ ]( B* [! q
2。不用一次反复吹打60次，可以每次吹打15-20次，静止取上清，再加入消化液体，重复以上操作2-3次。这样不至于已经消化的单细胞，反复吹打，消化损伤为碎片。

作者: cyumin123 时间: 2010-12-30 11:02

神经干细胞的传代我们也一直没做好，用胰蛋白酶消化的话涉及到消化时间，消化浓度等问题，机械吹打的话关键是吹打的力度和吹打的次数，而且对细胞的损伤比较大。我们这边传代是采用机械吹打大概四十次左右，把神经球吹小，全部吹成单个的话后面很难成球，可能它的结合力破坏了吧，所以吹成小团的，发现效果还好。我这边不采用胰蛋白酶消化，因为终止的时候是用血清终止的，怕洗不干净，后面的细胞就全分化了。不知道各位用胰蛋白酶消化的朋友有什么好的方法，具体方法如何啊？

作者: xiaodiao123 时间: 2011-1-6 08:59

我们是这样做的：收集细胞培养液，1000r/min离心2-3min富集神经球，弃上清，然后加入1mL左右的液体用1ml的枪尖机械吹打，60下左右太多了，稍吹打几下或十几下便可，吹打太多，细胞可能就会死了。

作者: happyhn 时间: 2011-6-8 11:13

楼主的问题解决的怎么样啦我也遇到这种情况

作者: angelyannan 时间: 2011-6-10 21:15

最好把神经球的培养直径控制在150um以内，我试过的，神经球越打越不容易打散，过度吹打造成的损伤很大，一般文献会说代神经直径达到100um后传代效果比较好。

作者: rhmm 时间: 2011-6-18 21:52

我都不敢用胰酶消化，感觉神经干细胞太脆弱，只是直接吹打，可是传代效果并不理想，请问各位你们说的胰酶加EDTA是哪个公司的呢，我只是用的Hyclone的，感觉不错，用过gibicol胰酶替代物感觉不理想

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