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标题: 看看我的 小鼠iPS细胞经过 EB分化的问题（附图） [打印本页]
作者: 上海过客    时间: 2010-6-23 08:42     标题: 看看我的 小鼠iPS细胞经过 EB分化的问题（附图）

我用的是 H- DMEM。15% FBS，NEAA， 丙酮酸钠，β-巯基乙醇， 谷氨酰胺 的 配方不知道  " d; }) R; k( k5 p% E
, F2 q2 E+ G, p: y, I6 d! V
做了 三次 成功了  一次 ，不过这一次  24孔 都有跳动细胞 。
" L4 m9 Q9 O! N$ k- o% `
$ s2 |; o+ c$ c% [" K% K$ J( p   另外 的 细胞 ，感觉  EB 中央隆起的 地方 都 破了 ，不知道 是什么原因呢 ？' |& o  C. Z3 _! T1 e

4 {6 I! I  i4 F想知道的 是 1  做 EB的 细胞浓度, K7 S- f, B6 l. x1 j5 c' v
            2  换液时间
& C" r2 S$ q, `            3  培养基的问题
' H, E1 L2 {- i; Q+ Z5 @! D6 ^            4  我的EB 中央 为什么会破
6 ^: V0 Q) |# o. l1 I
2 f( N/ v3 Y' U  h- I9 D4 l8 X* d7 ?* o! j- s6 {7 |& ^
看图
作者: 上海过客    时间: 2010-6-23 08:45

第二幅图的 中央 细胞 团 好像 烂掉了 。
5 D) j% e3 ?( O/ e! N8 W. Q+ x" R* w+ i- Z6 B5 M
不知道什么原因。
5 N' F5 ^( J4 ?: |% K* x( \5 T3 ?. m, G( @% w3 n/ a8 U
但是前面 做过三次 ，有一次成功了，24孔 都有跳动细胞。  其他两次和 上面的图相同
作者: flyboly    时间: 2010-6-23 15:15

IPS是怎么培养出来的啊 可否共享下资料
作者: flyboly    时间: 2010-6-23 15:16

我很是期待啊可是分不够级别不够 没办法看不见啊
作者: sacia    时间: 2010-6-23 17:27

我在ESC经EB诱导过程中也遇到过类似情况
% B" N+ D+ f# ^, u* O! k( \, q个人觉得，应该是制作EB的细胞状态不是很好或者是EB分化过程中，因营养物质不够导致细胞衰老、死亡。
作者: dulaiyouyu    时间: 2010-6-23 21:15

楼主iPS的pheres看起来很不错。
作者: cortex    时间: 2010-6-24 13:36

第一幅是正常的EBs图片
  P( l- j7 h3 w8 F. `0 u第二张看起来细胞都已经死掉了。可能是营养不良吧。。。也可能是团块太大，或者，细胞状态的问题。如果细胞被支原体污染，也会出现这种情况。具体的就得楼主自己判断了。7 b' u, ]: w1 Y$ Z
你做的EBs细胞团块有多大？起始一般1000个细胞子左右的细胞团块为佳。密度也不要过密。如果太密了，就要勤加培养基，或者转移到新鲜培养基中。
作者: 上海过客    时间: 2010-6-24 13:59

楼上 ，  拟胚体  转移到 24孔板 后 ，换液 时间 大概是多少 呢？
作者: 上海过客    时间: 2010-6-24 14:04

本帖最后由 上海过客 于 2010-6-24 14:08 编辑
1 R) Y0 a' Q0 j1 ?; o; i
$ `  [) ?( C; s$ x' F- I2 B8 S嗯 ，那我的密度是有点大了 。+ J7 a" ]3 M4 ^5 T2 u9 R/ B
% }" d3 ^2 J9 ]# o
( c; z! q% T8 d( A2 Q
我的 起始浓度时  12万/ml  .20ul小滴  。大概是  2400个细胞/滴 。3 H- N% M$ l  V! ?0 v0 v
" o" ^: l) f+ x, S# z
那就是 密度 有点大了 。  / _1 N' |0 d5 Q& V( k- i
" }$ J, r! b( g- t5 o+ N
4 m5 _+ [; b$ ~* }$ x
用 细菌培养皿  培养的  EB 感觉  很小，但是状态更好 。  我再试试这个方法
作者: 上海过客    时间: 2010-6-24 15:54

我刚才比较了一下 分化培养基 。* V+ Y% |8 h) Q# [3 ^5 k

" y7 ?9 k/ q6 z: I加了 丙酮酸钠  ，不知道是不是  这个问题 。
* q: o" Z* c+ X0 \
& k" n! g# \6 X8 {不加丙酮酸钠的  培养基已经配了 。  等等  看结果 。
作者: shewawa    时间: 2010-6-28 00:46

回复 1# 上海过客 5 L: v# L2 h7 _* f7 E) _, J; G
EB 分化胚胎干细胞的要求很高，你的胚胎干细胞必须制作精良。和液体没什么关系，
( c" s8 Q% i! V% L& }4 ]% r) l问题1：浓度不是很重要，iPS的好坏有关，我做过十个干细胞的分化也没失败。1000000也没失败，所以我觉得这个没有关系。* B7 i9 y4 s3 p" I! e# ~0 y5 e9 X
问题2：每天换液一次，换一半
* V; ^( e! X. y  \. r+ X% H问题3：DMEM FBS NEAA 2-M L-grutamin P/S具体浓度估计都是一样的，你找论文看就行了。
- W' V4 n6 U- Z. w2 d问题4：不清楚，估计是死了。实验室有人的EB也变成那样了，不过我没问为什么。& g! V/ C- ]  a$ B. s
& a' d, m) `' Z" v. k( \
希望能帮到楼主。也希望有问题能和楼主讨论。, W3 W8 z, n, g6 b% ?+ j2 i' Q
请问你说的细胞跳动是怎么回事？是在做心肌细胞分化吗？
作者: 上海过客    时间: 2010-6-28 16:42

回复  上海过客 2 ]1 l8 Q' I& H9 u% d
EB 分化胚胎干细胞的要求很高，你的胚胎干细胞必须制作精良。和液体没什么关系，
# [7 _% F; q' I! g问题1： ..." H, G  W6 Z, m2 D) T6 [7 J( |
shewawa 发表于 2010-6-28 00:46
2 R! M" o  L2 @9 r) t

  h& L! X) ~4 i/ p; J" s" v5 F; E  C7 l" n; X8 {( P
谢谢帮助 ，  是 做的 分化 ，但是不是做心肌分化，就是自由分化
作者: cortex    时间: 2010-6-29 09:56

回复 8# 上海过客
2 Q, Y2 s# y: G; E' S6 g: ^
' C7 f2 U- T# y; M' k5 j0 @" V" P  y7 z$ Z
    我们一般是刚开始隔天加一倍培养基，（起始0.5ml）后面细胞长起来后隔天换液（1ml）。
作者: yanyuanmm    时间: 2010-7-4 00:13

小弟，你是换液的时候把中间的吹掉了吧
作者: amazingt    时间: 2010-7-13 15:43

我做EB都不换液的，拿60mm的平皿加足够的培养液，不换液一样可以形成EB。而且细胞密度无所谓了，多少都可以
作者: juan880929    时间: 2010-7-13 15:59

起始细胞密度最好是1000个细胞每滴，只要能够形成EB，细胞量尽量控制小一点，还有看看是不是饲养层没有去除干净
作者: juan880929    时间: 2010-7-13 16:00

好的EB中间应该有很多囊状空泡
作者: pheebs    时间: 2011-6-13 11:34

没有具体的protocol吗
作者: rain2402    时间: 2011-6-29 15:51

这个不是很清楚。学习学习
作者: iytbxxg    时间: 2012-3-15 10:56

我都想知道怎样做的
作者: FYH    时间: 2012-3-17 03:12

回复 上海过客 的帖子% O" O# y- c5 X4 J6 C
$ }) |# D! _  A) q" I, m
yiban  
作者: FYH    时间: 2012-3-17 03:13

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* K9 e, f7 n# t, x& ^* P9 [9 f, o; `
wuran la



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