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标题: 关于用MEF做ES/iPS细胞鉴定的隐性对照问题。请看山中伸弥教授06年文章图片。 [打印本页]

作者: 上海过客 时间: 2010-6-29 10:57 标题: 关于用MEF做ES/iPS细胞鉴定的隐性对照问题。请看山中伸弥教授06年文章图片。

最近再做ｉＰＳ细胞的培养，想鉴定一下干性基因的表达情况。目的基因为 OCT 3/4,Sox2,Nanog,b-actin% Y. c- m* D) j  X2 A8 [% s
) p- w! J$ S! y! N+ s
OCT3/4 ,SOX2 是跨内含子的，Nanog 是没有内含子的基因序列。

不管是 DNA酶处理或者是不处理 RNA ，MEF都会扩增出条带，。但是条带很弱。这个问题非常困扰我。( R( w: W% U$ i6 {8 q

于是经过  优化，把 PCR的循环次数从30改为25后，拍的照片MEF 就没有三个干性基因的条带了。4 N- W2 t6 r3 w
! k: Y4 K" Y6 n+ F
于是我翻出 yamnaka 06 年的那篇  Cell 对照了一下。这个文献的这个照片是不是存在同样的问题？
[attach]9844[/attach]

SOX2，OCT3/4,NANOG 的三个基因在 iPS中的表达条带都很低，ES很高，MEF 根本就没有条带。既然 iPS和 ES 的干性差不多，那么条带也差不多亮。

我想这篇文章里的 PCR 循环次数如果加到很高，iPS 的 SOX2,OCT，NANOG  的条带会很亮，同时MEF可能会扩增出条带。
, s+ z1 e5 g: i- \# U' C
" h6 v7 d0 i/ C- Y2 h# `  O" F
这个就是我的问题，MEF中本来就有细胞表达这些干性基因。 06年的文献故意避开了这个问题。  " t4 z1 ^4 K. s

2 n: ~3 `% c4 c& g
请大家讨论一下，有说的不明白的地方请指出。我会补充

作者: 栀子花开 时间: 2010-6-29 13:52

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数

作者: have-a-rest 时间: 2010-6-30 14:21

PCR结果就是这么不可信！

作者: 刘实 时间: 2010-6-30 17:48

引了你的文并发了评，见http://blog.sina.com.cn/s/blog_502041670100jec6.html

作者: 上海过客 时间: 2010-6-30 17:55

MEF 的Nanog是可以隐约看出条带的，不知道原文中说没说PCR的循环次数# L( Q; F; A+ G- m* v
栀子花开发表于 2010-6-29 13:52

. l8 S* V0 p8 }; a
& R' a2 h: s. f$ y) {' g# h
NANOG 这个基因比较特殊没有内含子，所以如果有基因组污染的话，可以扩增出来。

1 |2 W. l9 V l
也不知道怎么下这个结论。请大家多讨论。

作者: marrowstem 时间: 2010-6-30 22:28

Very good question.% J+ n# c# X" U5 `" e0 w1 ], |
建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。
有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求证。

作者: 上海过客 时间: 2010-6-30 23:20

Very good question.* f$ I' j" p) y# @& B. z
建议深挖，说不定挖出一个“大宝藏”。
, f% N% w, m2 [6 w# V& ?有时不妨相信一次自己的直觉判断，然后设法求 ...
* H) C. |& X0 X8 zmarrowstem 发表于 2010-6-30 22:28

为了做判断。我已经决定用提的总 RNA 来直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明有基因组的污染。

DNA酶的处理和 RNA的提取方法还需要改进。

作者: 上海过客 时间: 2010-7-1 16:25

NANOG 这个基因比较特殊没有内含子，所以如果有基因组污染的话，可以扩增出来。 % L- [$ M* n' [& X. _( r' m

2 R) X( V. q8 h3 ~3 l
) G5 d" I; J: Q1 s6 M$ F也不知道 ...
3 J! L# l& d: g. U; E3 N上海过客发表于 2010-6-30 17:55

2 m& s3 a/ N: y
搞错了 SOX2 没有内含子。不好意思。

作者: 上海过客 时间: 2010-7-1 16:28

为了做判断。我已经决定用提的总 RNA 来直接做PCR ，如果 PCR 有条带，说明有基因组的污染。 ...
+ z2 ~" V$ I# r+ i% N$ a上海过客发表于 2010-6-30 23:20

, m' l1 G, N2 C; D; d

这个也不是太懂，今天才搞懂，山中文章图片里最后一栏的 RT-MInus 就是直接用RNA样品来做 PCR 以检测 RNA 样品里是不是有 DNA模板的污染。7 X; V" f. W$ D# v
. t! R: ~: C" ?% |- {7 k
我看了一下大概 RT-MInus 就是这个意思，不知道理解的对不对？

作者: 上海过客 时间: 2010-7-2 08:10

这篇文献的 WESTERN 的结果。可以对照 RT-PCR 的结果。 OCT3/4,Sox2,基因 RT结果 iPS 与ES 基因差别较大，蛋白印迹确实差不多的强度？什么原因？

7 Y" w: v) X0 J# m: m

蛋白印迹内标换为 β-actin . RT-PCR 为什么要用 Nat1 来做内标？搞不太懂。

作者: 刘实 时间: 2010-7-2 10:15

希望上海过客打破沙锅问到底，最终是会水落石出的。

作者: ambassador 时间: 2010-7-2 21:23

这篇文献的 WESTERN 的结果。可以对照 RT-PCR 的结果。 OCT3/4,Sox2,基因 RT结果 iPS 与ES 基因差别较 ...
% }& |5 [& {8 w7 f4 r上海过客发表于 2010-7-2 08:10

( J, H5 C0 w& J1 X& k
) J- _; }5 `" d) u
   强度上来说加40ul应该没有问题！蛋白含量在实验前都是经过严格标准化的！

   western 是蛋白印迹，当然用β-actin这种蛋白，而RT-PCR检测的是DNA序列，用的是nat1基因序列，有什么疑问吗？内标只是一个参照。' J+ K# u# Z: F2 `6 s. f: v) Z
   RT-PCR中，在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
   west中，一般内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。选择β-actin肯定是为了更好的分离出其他蛋白的缘故。内参的稳定，是以一个细胞为基本单位，也就是在刺激下，各个细胞的内参量是基本相同，在其他蛋白变化的同时，也不随刺激变化。所以作为参照物。

作者: ambassador 时间: 2010-7-2 21:30

这个也不是太懂，今天才搞懂，山中文章图片里最后一栏的 RT-MInus 就是直接用RNA样品来做 PCR 以 ...
0 `# u/ V7 J0 q6 t; D6 ~4 i上海过客发表于 2010-7-1 16:28

9 U- I* \0 r7 k& O; D

minus就是缺失的意思，应该是这么解释。我查看了下原始文献，摘录一段给大家参考（666页左下段）：
8 Q9 H8 S% @6 b; |
No combination of two factors could induce the formation of G418-resistant colonies (Figure 2C). Two combinations of three factors—Oct3/4, Sox2, and c-Myc (minus Klf4) or Klf4, Sox2, and c-Myc (minus Oct3/4)—generated a single, small colony in each case, but these could not be maintained in culture. With the combination of Oct3/4,Klf4, and Sox2 (minus c-Myc), we observed the formation of 36 G418-resistant colonies, which, however, exhibited a ﬂat, non-ES-cell-like morphology. With the combination of Oct3/4, Klf4, and c-Myc (minus Sox2), we observed the formation of 54 G418-resistant colonies, of which we picked 6. Although all 6 clones could be maintained over several passages, the morphology of these cells (iPS-MEF3) differed from that of iPS-MEF4 and iPS-MEF10 cells, with iPS-MEF3 colonies exhibiting rough surfaces (Figure 2D).

作者: lixiaodong 时间: 2010-7-3 14:03

回复 10# 上海过客 # q6 L! t" p. M
beta-actin mRNA丰度太高，可能不适于作半定量RT-PCR，作Western则易于检测（但有文章说GAPDH更合适，因actin的结果很难达到半定量效果）。PCR的检测敏感度很高了，不表达和表达量低很难界定，有可能有假阳性吧，Western如不是优化后其检测灵敏度较低。免疫组化的则可以提供单细胞水平的检测。另外还有一些GFP的reporter mice，也可用来鉴定MEF中是否含有Stem cell吧。总之各种检测方法都有其优势和局限性的，多种方法交叉验证才能得到可靠的结论。

作者: 上海过客 时间: 2010-7-3 14:20

回复上海过客 2 Q9 \1 b0 m O& O4 l( ]1 h
beta-actin mRNA丰度太高，可能不适于作半定量RT-PCR，作Western则易于检测（但有文章说G ...) H7 C+ p- H- y. h5 N7 v
lixiaodong 发表于 2010-7-3 14:03

8 ]- U1 w' b- ?

现在的实验还都是做群体的细胞  效应，单分子水平很难做。  单个细胞表达 GFP 可能在  群体里也体现不出来。  我并没有否定他的论文，只是感觉到的确是有些问题解释的不太清楚。
1 d! i8 Y  h4 A) j
PNAS 上现在有一篇文献说明在成纤维细胞中提纯了多能干细胞。如果是这类细胞  被重编程呢？    . g/ p5 D! ?7 B+ n# a9 J9 W5 F7 X

关于内标的问题，我也仔细看过了文献，β-actin ，GAPDH， 16SRNA 都可以做内参，但是怎么选？ β-actin  虽然在普通细胞中不变，但是干细胞中，尤其分化过程中变化很大，做过的同学知道。GAPDH 是糖代谢的基因，胚胎干细胞和普通细胞的代谢途径不同，这个大家知道吧？  尤其是小鼠的 ES细胞的代谢途径，去年有最新的文献。  但是选NAT1 是什么道理？ 9 T, l0 N6 W" r7 s5 x7 u$ }
6 S3 R/ @/ c& {9 C2 |- O
   PCR 本来就是来做鉴定的，如果有假阳性。对于这么一个突破性的进展论文，有些牵强。  real-time PCR  为什么没有做呢？曲线就很容易看到区别了吧。             那他不做，有机会，我来做real-time  PCR  吧  。

作者: cicadacjk 时间: 2010-7-3 14:27

yamanaka第一篇文章中的iPS有很多是重编程不完全的，直到用Nanog-GFP(2007 Nature)作为reporter后，所得到的iPS细胞才大多数完全重编程。
所以06的文章中，只有少数的几株细胞被用来做最后的验证，比如你这张图，yamanaka在原文中就指出所得到的细胞多数并不好，后来在TTF的iPS中也只有几株比较好，有一株形成了13.5天的嵌合体。你引用的western图，是拿这几株细胞做的。此外，甲基化结果也证明yamanaka那些克隆Oct4启动子未曾完全地脱甲基化。之所以会有这种不完全重编程的情况出现，和当时用的是Fbxo15-neo的细胞是有关系的，实验表明Fbxo15在重编程的前几天就开始表达，它自己本身也不是核心的多能性基因，因而筛选出半桶水是非常正常的。3 g q! Q* n, `+ r
而在现在的技术条件下，用Oct4-GFP或者Nanog-GFP作为reporter，得到的iPS细胞系90%以上都可以形成存活的嵌合体。分辨内源激活层面的重编程已经不是难题。
6 @ A: p; H( R. O
半定量PCR的假阳性问题是很正常的，使用定量PCR可能会更好一些。此外，在南京模式动物中心就有OG2小鼠出售，如果想iPS好挑一些，建议还是用这种小鼠的MEFs做实验吧。如果你没有这种小鼠，可以同时感染GFP病毒（假设你用的是逆转录病毒），这样你专门挑GFP沉默的克隆，效果也很好。

作者: cicadacjk 时间: 2010-7-3 14:31

回复 15# 上海过客 2 t, r: O( Q. W' P

当时yamanaka的研究经费是很少的，选择较为廉价的方法也很正常，况且半定量做图的好处就是一目了然，有时候即便我有定量结果，也会倾向于用半定量放在主figure中。
GAPDH做内参没什么问题的，如果你实在信不过，再加个18s，你就相信了。

作者: lixiaodong 时间: 2010-7-3 14:38

回复 15# 上海过客

许多技术细节确实值得推敲，精益求精。希望你把你的新发现公布。Real-time PCR确实比半定量严谨一些，但除非是拷贝数是0，否则还是不能给出有或无的答案。但群体水平的检测确实很难如实反映小概率事件，大海捞针嘛。弱的信号不能鉴别如下两种可能： 999个0和一个1 vs 1000个1/1000。

作者: 上海过客 时间: 2010-7-3 14:57

yamanaka第一篇文章中的iPS有很多是重编程不完全的，直到用Nanog-GFP(2007 Nature)作为reporter后，所得到的 ...
5 w! t7 _. z* R6 J4 ~* ~cicadacjk 发表于 2010-7-3 14:27

0 m8 ~7 e7 V6 b% L$ y

谢谢你的回答，你的回答引导我更深入的学习这篇文章。
/ g% V7 ^  _8 K. `* T8 X
这篇文章，我看了至少有5遍了，注满了注释，但是可能还是没有看懂。如果你有时间的话，请详细再解读一下这篇文章。* x" j1 o( T! J+ b2 C

      谢谢

作者: 上海过客 时间: 2010-7-3 15:07

可能有许多地方考虑的不周到，希望大家不要见笑。:handshake

作者: cicadacjk 时间: 2010-7-3 15:26

回复 19# 上海过客
5 @+ j' s c. h1 B. f R+ U3 c! }* x
5遍还是很难完全看懂的，我刚进实验室至少也看了10遍4 s G7 ?+ Q. X* K! l) j* D9 A
做完一年实验回头看，发现当时其实只看懂了一点
还是要多看其他文章，开始盯他的文章，学到的只是鉴定的技术

作者: lixiaodong 时间: 2010-7-3 15:31

回复 16# cicadacjk * A c) K1 Z- T+ ]$ l

学习了。

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