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标题: PCR 之个人浅显见解 [打印本页]

作者: philexchang 时间: 2010-7-7 23:36 标题: PCR 之个人浅显见解

Primer is a significant component of the PCR system. Here, we defined a system, which is composed of a few of visible components(such as primer, template, dNTPs, MgSO4, TaqEnz etc.), time(denature, annealing and elongation) and temperature(the same to previous).Primer is one member of these visible part, a determinant element.

Actually, primer is a strand of nucleotide, it served as a starting point of the synthesis of new DNA. The cDNA(complementary DNA) extended from the 3' end of he primer, in PCR system. It is designed by researchers, and there are several basic principles for primer designation!$ o1 v/ \# m8 x& I
: B4 D9 M- W, O

1 j+ V. Z( h) ]( y7 W) ]

Basic Principles:

15-30 bp+ @9 J4 L0 w2 ^$ I+ G4 H5 x
3’ end critical pairing rules) |6 T/ ?' y, c$ w& ]! [
5’ end should be modified
No hairpin!# x- K* B, L2 b5 e; m
No self-pairing(forward & reverse)
Tm!( Q+ j& A" r; m* T' O& W' Y
A T G C is randomly distributed G& r7 x+ k7 e* ` V5 C
owning specificity
... ...3 C# ]' q8 X3 K

Auxiliary Softwares for Primer Designing!$ }! @0 D. C; p
( w \, v1 X' f% b6 I7 K
There are some softwares designed for the molecular biologic researchers all over the world, such as Oligo 6 and Primer Premier 5.0; U! L( c7 Z: K
' B' q# j4 M& w: ?" p% r+ L5 b! o

! I# `( q) p' x& W5 |" H) o# `0 X
To be continued! - X' j8 T' r) N% g0 I2 ?8 u
+ _3 ^! C0 n6 R1 v

   引物是人工合成的两段寡核苷酸　　PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

　　在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链X相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。  g& r: b  Y, F
, G* B3 M/ r* f/ o6 c8 {
引物设计原则：
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计
2.引物长度一般在15~30碱基之间7 ^8 \- _9 Z% F
3.引物GC含量在40%~60%间，Tm值最好近72℃
4.引物3′端要避开密码子的第3位
5.引物3′端不能选择A，最好选择T$ v' X/ \- E9 s6 J) k# J
6. 碱基要随机分布1 a9 r" n' Y7 {% j4 M6 o: i
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列# H% [8 t9 m0 ~6 f9 w! Q
8. 5′ 端和中间△G值应相对较高3′ 端较低& _" Z" _7 Q; Y7 D  M5 {, O
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰" r& U- f/ W$ ?. o$ \" V7 z# a
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构
11. 引物应具有特异性。

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作者: philexchang 时间: 2010-7-8 09:19

海洋的奖励让我受宠若惊呵呵多谢！

作者: 细胞海洋 时间: 2010-7-8 09:24

支持原创必须地

作者: guochutao 时间: 2010-7-8 13:30

支持原创是必须的，然而凡事需有有度！

作者: meilin0118 时间: 2010-7-9 11:10

好多威望阿!

作者: zhmgeneral 时间: 2010-7-9 12:32

棒！

作者: philexchang 时间: 2010-7-10 10:04

回复 5# meilin0118 / X, u( H* g) d8 _& q$ W7 s

# P+ i/ I2 A) q) t: Q8 l+ M) e; W
只能说海洋很照顾我了呵呵不过东西确实是通过这两周自己接触总结出来的虽然很浅显呵呵

作者: 芷瞻 时间: 2010-7-11 14:31

Tm值最好近72℃

' C7 A1 E! `# X; y
Why?

作者: hawkyiger 时间: 2010-7-12 10:48

同楼上问

作者: hljzyydx 时间: 2010-7-12 14:23

不错，论坛需要这样，需要大家拿出自己的东西，而不是一味COPY

作者: deron 时间: 2010-7-14 16:57

这么多威望很让我们嫉妒和眼红啊&&&

作者: philexchang 时间: 2010-7-15 09:26

回复 8# 芷瞻
5 Q1 R# m6 p6 R6 I$ v8 [' {
- T3 }0 g$ g& g
Tm值是根据体系引物，酶来决定的。我目前用的在50-60之间，多谢指正！

作者: neway127 时间: 2010-7-15 19:55

回复 12# philexchang

% M- J. B8 C* R; q, M4 p7 V
差不多啊，接近聚合酶的最适温度，就行

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