- U! z2 Q0 n: C; }6 ] 6 H" N: z: @8 P; ]- \1 i+ a0 \9 I4 E, v
# z) |9 O# P' H7 {
% u' b! Q7 v- N" O0 w2 v
7 h" ~+ J4 |+ C D& }! l 3 Q& F: o! }& ?; n- r1 Y9 w- @
0 |8 ?! m6 I- f
' s) g8 W: n0 a' T5 A & ^3 S1 n2 N2 ?( r% P8 O
4 `5 I( o' U# S1 i& d) x& b, k4 T
【摘要】 目的 探讨碱性成纤维生长因子（bFGF）重组腺病毒转染骨髓间质干细胞（MSCs）促进VEGF的表达。方法 采用酶联免疫吸附（ELISA）法对转染bFGF重组腺病毒的MSCs实验用小型猪急性心梗模型血清中VEGF含量进行测定。结果 细胞移植后即刻组Ⅰ与组ⅡVEGF含量无统计学意义（P＞0.05），移植后第1w两者比较就有显著差异(P＜0.01)，而且组ⅠVEGF含量达高峰，第2 w、第4 w组ⅠVEGF含量与组Ⅱ比较差异仍有统计学意义(P＜0.05)。结论 bFGF重组腺病毒转染骨髓间质干细胞促进VEGF的表达。 $ \/ J+ p! k: W& d; ~8 }1 v
【关键词】碱性成纤维生长因子；血管内皮生长因子；骨髓间质干细胞 * _( h- O5 x9 J8 T1 D 基金项目：吉林省科技厅科研基金资助（20037004） ) z, F) y" k7 {2 ^, e0 b! E , Y0 j" F z* I* Y* ~ 近年来细胞移植和基因治疗缺血性疾病成为研究热点。研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)基因转染骨髓间质干细胞(MSCs)移植能显著促进缺血心肌血管再生，改善心脏功能〔1〕。而用成纤维生长因子(bFGF)重组腺病毒转染骨髓间质干细胞促进VEGF表达少有报道。本研究采用ELISA法对转染bFGF重组腺病毒的MSCs实验用小型猪急性心梗模型血清中VEGF含量进行测定，探讨bFGF重组腺病毒转染骨髓间质干细胞对VEGF表达的影响。9 {$ M( q. L, o
7 h: R7 Q) |9 E" d9 J. |/ g) l6 d 1材料与方法) ^7 X, \& k: Q" q
" k/ D# [ r+ D: F( c( ?, d 1.1材料健康中国小型猪，8～12月龄，体重25 kg左右,雌雄不限（吉林大学实验动物室提供），携带bFGFGFP基因的重组腺病毒（由吉林大学王苹博士惠赠），羊抗人bFGF抗体(北京中山生物公司)，FITC标记的兔抗人IgG(北京中山生物公司)，VEGFELISA试剂盒（北京晶美生物工程有限公司）。 7 ^6 H2 [* L0 r) K + ~, z% [4 o( c 1.2方法 0 Z3 ?; p7 g/ Q2 h! y! @/ u# {# @) u$ U
1.2.1猪骨髓间质干细胞的分离、纯化、培养及猪急性心梗模型的建立方法参照参考文献〔2〕。 : ]0 g; |. K3 S4 V! W V7 {1 u0 [- H2 E. U8 i* T4 f) J
1.2.2bFGF重组腺病毒对骨髓干细胞的转染在转染之前把猪骨髓MSCs培养液吸出，用DMEM洗一遍，加入不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的bFGF重组腺病毒(用DMEM稀释)，MOI分别为0，5，20，100，200 Pfu/细胞，以PBS为对照，37℃振摇2 h，之后吸出病毒液，每孔加2.5％新鲜培养基1 ml。此后每12 h在荧光显微镜下观察一次GFP的表达情况，感染48 h。免疫荧光染色。 8 d* }0 g% G8 s! z3 v# m" a* d : ?" a. E B& ^6 g! o 1.2.3细胞移植及分组心梗模型建立后即刻,用氯胺酮、速眠新将猪麻醉,无菌条件下分离股动脉,造影见左冠状动脉前降支（LAD）远端完全闭塞。6FJL3.5造影导管放于冠状动脉口部,沿导丝送入2.0 mm或2.5 mm OTW球囊放于LAD远端,将球囊充盈打开堵闭LAD,随机分为2 组。组Ⅰ（n=8）通过球囊内腔注入转染bFGF基因的MSCs细胞100 μl；组Ⅱ（n=6）注入不含血清的DMEM 100 μl作为对照组。分别于移植即刻、移植后1、2、4 w取猪静脉血5 ml，EDTA 抗凝,10 min内分离血浆,置-20 ℃冰箱保存。用ELISA法检测血浆VEGF水平，步骤如下：提前20 min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条。除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准样品（100 μl/孔）加入相应孔中后，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90 min 。洗板4次。加入底物显色剂，37℃孵箱孵育15 min。加入终止液100 μl，混匀后即刻测量OD450即值（5 min之内）。绘制标准曲线，读取数据。 G( b' y7 c. d+ o9 h # r' x$ p- m! @8 u 1.2.4统计学方法应用SPSS12.0 软件包进行统计学处理。计量资料用x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。4 X# x/ i, i" i; N! R \" y
% s: Z5 u+ a3 o9 r, f# `% _' d 2结果 ( ]+ E2 ]% k- b+ P1 ~1 I1 M : B9 Q+ l9 O- ] 2.1bFGF重组腺病毒对骨髓干细胞转染效率鉴定bFGF重组腺病毒对骨髓干细胞转染后经免疫荧光染色，在荧光显微镜下呈现绿色荧光者为阳性细胞，未感染的细胞则无着色现象（见图1）。随着MOI的增加，染色阳性率亦增加，当MOI为100时心肌细胞荧光着色阳性率达95％（见图2），说明本方法构建重组腺病毒体外转染率高，目的基因能有效地得以表达。 ; F; f$ f5 w e( L$ }. k1 H5 D% X0 J$ Z
图1转染bFGF重组腺病毒的MSCs表达绿色荧光蛋白（200）（略）& @- { g! Z, ?, a
! ^% S$ Q! j! q$ k) d
图2bFGF重组腺病毒对骨髓干细胞的转染率（略）( t& V: C [4 y" a1 Z+ X
" ]1 r4 W' A% {7 O9 T
2.2细胞移植后各组VEGF水平的变化细胞移植后即刻组Ⅰ与组ⅡVEGF含量无统计学意义（P＞0.05），移植后第1周两者比较就有显著差异(P＜0.01)，而且组ⅠVEGF含量达高峰，第2周、第4周组ⅠVEGF含量与组Ⅱ比较差异仍有统计学意义(P＜0.05)。 3 W5 @. h; n% |2 W- Z7 Q( Y( l# Z2 t! M 2 S7 i1 R, C Y. }) b; r 表1细胞移植后各组VEGF水平的变化（略） # D! E$ J. w, n3 l" ] X7 _2 F# T" @
# P5 D3 G4 ^- }: C . j; W" I# r/ {6 M) T 与组Ⅰ比较：1）P＞0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.05 2 Q0 d" y% V' I1 B" F8 C# Y 6 R& }# }' b) o/ d$ |7 k 3讨论$ b) C% k3 O$ |; m- z. s( x$ R
! E5 F# A! n Z5 _6 n; w
+ |, _ \, g l1 S4 `+ G0 n7 n6 ?% r$ l" W) b
, J. o1 ^$ K6 w4 H9 N9 @
bFGF 的血管生成作用部分是通过调节VEGF 的表达及生成实现的,bFGF通过与VEGF基因的启动子SP1 区(cfos区) 结合并使之激活,导致VEGF的表达增加,从而促进血管再生。研究发现,bFGF能显著提高局部VEGF 的表达水平,显示外源性bFGF可能诱导局部生长因子(如VEGF等) 的表达,增强细胞增殖活动〔12〕。bFGF还可通过诱导细胞内VEGFR2的表达增强VEGF的作用bFGF有四种形式，以AUG为起始密码的相对分子质量为18 000和以CUG为起始密码的相对分子质量分别为22 000、22 500 和24 000 〔13〕。 通常人们把CUG起始密码的三种形式统称为HMW (high molecular weight) 。而在这个促进VEGF表达的过程中相对分子质量为18 000和HMW bFGF都有作用。相对分子质量为18 000的bFGF 是通过旁分泌、自分泌或胞内分泌后与FGFR结合后进入细胞核，然后作用于VEGF 基因的上游序列,增强VEGF 的转录，从而使VEGF 表达增加〔14〕。/ K G5 ?3 O. I0 m0 v. ^
0 A7 A$ t* Y+ g! O: V& {) ^4 e ! O( G1 I8 ~: X, b& ]. h4 d6 ] j7 r- e7 B, d( M9 m
本实验用bFGF重组腺病毒对猪MSCs转染，实验结果显示，转染组血清VEGF水平显著高于对照组，说明bFGF重组腺病毒转染MSCs显著促进VEGF的表达。研究表明，在正常的心肌细胞中有VEGF mRNA的持续表达,缺氧可以使VEGF的表达增加〔15〕。组织缺血后MSCs能自行迁移到缺血部位，并在缺血环境中横向分化为血管内皮细胞等，参与血管新生和促进组织功能恢复〔16〕。bFGF 等血管生长因子又可促进MSCs增殖并向血管内皮细胞分化〔17〕。但在急性心梗时仅凭自身的调节，缺血心肌局部分泌的VEGF水平不足以达到有效促进血管新生的目的，而联合基因治疗及细胞移植，通过多种途径可有效增加局部VEGF的浓度，达到治疗性血管生成的目的，进而最大限度挽救濒临坏死的心肌，改善心功能。虽然目前的研究只限于实验动物阶段，并未应用于临床。但此实验为临床应用外源性bFGF基因治疗缺血性心脏病提供了实验依据。 $ O, S$ q! G7 f( _& X 【参考文献】7 q6 M! u, g! P8 Z4 f8 A
1 高 峰，蔡振杰，李 利，等.血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植促进缺血心肌血管生成的研究〔J〕.中国实用内科杂志，2006；26（20）：16002.! y" V) C; K0 I- h9 N0 i- e
& P3 l' C; E$ s# }& m0 d8 `9 K5 ^( L9 u- p
9 V1 h) @& g- X% C) k% V- F+ G4 D
2 李树岩，李淑梅，董明慧，等.VEGF基因转染同种异体骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的实验研究.中国老年学杂志，2007；27(4):6225. 3 K. B. [! Q8 p3 d# e + z$ L4 b7 n2 B/ ? f1 ?( N8 E6 C8 t4 B2 @' r# h
) i" r! s5 ~1 `( J7 l/ {6 J
3 Presta M,Dell′Era P,Mitola S,et al.Fibroblast growth factor/ fibroblast growth factor receptor system in angiogenesis〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2005；16(2)：15978. 6 f; o$ x* m5 L, g! S5 i" W2 e4 j+ f9 O; C7 ]; Y4 j3 k
" r. O5 Y6 A' v
7 y- b; b a4 w5 r5 u
4 Pu LL，Holme KR,Symes JF.Heparinase enhances collateral vessel development in the ischemic limb〔J〕.Int Surg,2002；87:2608.4 { W& O/ ~ n1 P) }1 H0 r j
8 b5 y' f# J: R- V- ]( Y' F
: b$ w, [/ d. g+ z; ?) Y3 @" H& ?: C
5 李明焕,田 铧,刘执玉,等.ECV304 细胞用于三维血管新生的研究〔J〕.中国现代普通外科进展,2004；7(3)：1657.- s7 C, i5 a+ l# |" j8 h9 i
6 @! E) N7 }% d% s
+ J+ c3 a1 V( U! N1 P
( {3 K3 d7 h3 t$ E/ ~
6 杨 靖,毛晓波,曾秋棠,等.急性心急梗死后血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子表达动态变化〔J〕.中国介入心脏病学杂志,2005；13 (2)：1146.9 ]1 V! q2 ] w' t
1 ?+ `+ m' B) d5 K% z
% s b2 P* t/ M8 }! f* a S& o: c K1 H" Q, V
7 Ferrara N，Winer J，Burton T，et al.Expression of vascular endothelial growth factor does not promote transformation but confers a growth advantage in vivo to Chinese hamster ovary cells〔J〕.J Clin Invest，1993；91(1):16070.( H* G# i2 J2 _! }! \- c
% Y1 w# W0 C7 s( Y+ O. z. R3 f8 j 2 f9 @% ?- T$ h9 a( m _ ' x# V, V4 [$ o8 r 8 晋 军,向常青,黄 岚.血管内皮生长因子在缺血性心血管病的应用进展〔J〕.重庆医学,2000；29(1):779.0 Z1 y' N% w% \' d* K
6 b. I$ b' x' o7 z/ q; y/ R2 E$ g3 Q i
, D! }* `4 M6 j
9 Ferrara N，Smyth TD.The biology of vascular endothelial growth factor〔J〕.Endocrine Reviews,1997；18(1)：425.7 x- ]. _7 r8 k; v
" O0 s, ]: }( e& o9 f
8 B/ l* e1 q( ?, B1 v $ K0 ]2 ^- v9 R5 O 10 Li J，Brown LF，Hibberd MG,et al.VEGF，flk1，and flt1expression in a rat myocardial infartion model of angiogenesis〔J〕.Am J Physiol，1996；270(5 pt 2)：H180311. 9 G( D" E( u+ q: L, H. V6 s! j1 q9 t$ q
0 D5 C- a4 _! R& c$ l. D' M. Q, c# U4 I( x! {# u
11 Gerber HP，Dixit V，Ferrara N.Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl2 and A1 in vascular endothelial cells〔J〕.J Biol Chem,1998；273:133136., z; p2 ~- k) y o
, }1 z% g+ o) ~1 W
4 Z* N% ^3 C* A! k. o( } k7 C& T
12 Lindner V，Reidy MA.Expression of basic fibroblast growth factor and its receptor by smooth muscle cells and endothelium in injured rat arteries：an en face study〔J〕.Circ Res,1993；73:58995., Y, `7 y) M) t# L
, l" b$ e) i4 b& Z6 r % A7 i% [! o% O( E ; ]% ^% W/ X) ^* j" [% W: D 13 Yanagisawa Miwa A，Uchida Y,Nakamura F,et al.Salvage of infaracted myocardium by angiogenic action of basic fibroblast growth factor〔J〕.Science，1992；257:14013.. u/ E! h" Y% C: Z0 `, H/ e7 `8 a5 L
. L. M8 N1 `& a 1 ^1 N& e5 T v8 O6 g W' t& J5 ~/ L& h9 T1 f; R! R1 _% d4 z
14 聂绍平，蒋桔泉，曹林生，等.心肌内控制释放碱性成纤维细胞生长因子血管再生机制的探讨〔J〕.临床心血管病杂志,2005；21(1)：4951. 1 D+ T+ n2 g9 S. a' v4 d& A; L : p8 g0 v( P) q0 ? : @3 m0 W; N; m+ V6 m; h: j& K6 r 8 q! t% ~- A- A' i' Y 15 Banai S，Shweiki D，Pinson A,et al.Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischemia:implications for coronary angiogenesis〔J〕.Cardiovasc Res,1994；28:11769.- y% U D! b1 @; q1 `1 D
( K P% |# i; E% R A+ M6 n* _
' e$ `' b2 _& y3 n: T+ T + y( e/ t2 z. a! R$ E 16 吴贤仁，杨 敏,李玉光，等.骨髓干细胞动员对大鼠缺血心肌的治疗作用〔J〕.中国免疫学杂志，2004；20(7):4714. / d- x }9 d+ D4 s! ~' D8 c }, n" a) B$ \+ v( H
t- R) z/ \8 w( \# [9 o- x$ g4 c ?7 u8 q: J7 h1 r7 z
17 Shi Q，Rafii S，Wu MH,et al.Evidence for circulating bone marrow derived endothelial cells〔J〕.Blood,1998；92(2):3627.作者: laoli1999 时间: 2015-6-15 14:01