干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站
标题:
mES制备EB照片
[打印本页]
作者:
yaoyaoyatou
时间:
2010-7-15 21:20
标题:
mES制备EB照片
大家好!第一次制备EB,感觉很失败,不知道原因在哪里?希望大家能给我指点一下。
9 ` t& a9 j; p, F) b( t
我的EB培养基是:KO-DMEM, FBS,L-glu, NEAA, Pen-strep,meraptoethanol.
. ^2 k2 ]; D2 a# B
mES 的大概是10W/mL
7 j% q9 z' ]. k1 R. y4 r% }
方法一:20ul的小滴滴在皿盖上,倒扣在皿底,培养48hr, EB如照片所示,EB边界不清楚,形态不圆,分化严重。
" i! \% n* Y( u2 e: k+ `
方法二:将mES悬浮培养在细菌培养皿内,48hr后换液,EB状态同方法一差不多。
* }( v7 W$ R: l; S, Y' @* n) p
请大家看看我的步骤有什么不妥的吗?给予指点。
( q% O0 j |5 r+ H4 a, }
[attach]10613[/attach]
2 B) x5 Z+ X, j4 Q
[attach]10614[/attach]
* n$ s( P, ~1 c( N/ m4 G6 ?
[attach]10615[/attach]
作者:
yaoyaoyatou
时间:
2010-7-15 21:23
补张照片
x5 ]& S; b! r, v
[attach]10616[/attach]
作者:
痞子的烟头
时间:
2010-7-15 21:40
作EB之前一定要保证MES或HES状态要好,至于培养基LIF以外,其它都成份都一样
' M# n5 y8 T# \
还有消化作EB时,不要太过了,
作者:
xjya
时间:
2010-7-15 21:50
对于方法一 ,悬滴法,细胞密度一般是20000-40000/ml.小鼠培养基一般20%FBS的高糖含L-glutamin的DMEM。48小时后收集EB的时候要特别小心,用蓝色枪头收集,注意不要反复吹打,以免打散EB。
- y% B# ~. `: s( d4 X, L1 {) t
对于方法2,你是想用mass culture法吧。这个方法细胞密度一般是1000000/ml.但是要在摇床上不停的摇才行,48小时后稀释成1000个EB/皿,继续摇,直到相应的时间。
; Q! }& [, B& i+ o% j9 \, [- i& A
从你的图中看,大概是吹的太狠了,EB都散架了。
! g; F$ o3 w0 [. D1 d1 T- a0 h* W
还有一点我不明白,你觉得“EB边界不清楚,形态不圆,分化严重”,为什么说分化严重啊?好像这么说不妥~
作者:
wangzhuo822001
时间:
2010-7-15 21:53
关注~~~
作者:
xiaojunhu1985
时间:
2010-7-15 22:42
原因
! t4 H/ Q4 y8 S
一:小鼠的ES 状态本身就不好。
9 ?2 S: s1 a/ i; U' C
二:做好不要用FBS 培养,很容易贴壁。要使用血清替代物。SR
作者:
xiaojunhu1985
时间:
2010-7-15 22:42
这个问题我也遇过。尤其是在ES 状态不好的情况下
作者:
双刀
时间:
2010-7-16 11:04
ES细胞的状态很重要,另外的就是,楼主用的FBS用的是哪个牌子的
作者:
wangzhuo822001
时间:
2010-7-17 09:10
你说的方法二,是不是先由方法一悬滴培养两天,然后再悬浮培养?
作者:
yaoyaoyatou
时间:
2010-7-17 15:57
方法二是直接将ES吹散后悬浮在分化培基里,在细菌培养皿里悬浮培养,48hr后EB很小。比方法一EB要小很多。至于mES状态还是不错的。但是很奇怪EB为什么总是这个状态。
作者:
梦想lab
时间:
2010-7-31 18:09
ES状态好的话,形成的EB才能好。我用第二种悬浮做过,48hrs观察,发现还是比较均匀的,我种的细胞没那么多
作者:
erikoapril
时间:
2010-10-11 00:40
可以尝试增加每个液滴的细胞数试试看
作者:
henryjia
时间:
2010-10-11 18:32
除上述意见之外,如果仔细观察补充的第三张图,可以清晰地发现很多游离的细胞,且形态大小不规则 - 这是明显的细胞死亡征兆。ES细胞是非常敏感脆弱的,在收获过程中,很多因素可以影响:1,消化酶消化时间,2,离开incubator时间,保温状况。
2 h- _, B4 V9 u: u' F6 }7 i
/ ]. f; p' r( q9 N# K: J
此外,你所说的‘mES状态还是不错的’ - 是否指形态观察?这往往是不充分的。定期的characterisation 很重要。
作者:
henryjia
时间:
2010-10-11 22:02
补充一点,LZ说EB‘分化严重’ - 这不准确,因为生成EB的目的就是要诱导ES开始分化。
: {9 E8 k* t; S( R7 W; W* j
; v5 J5 @6 T( k/ y* {9 d/ T& n
我正在整理以前做的HES分化实验资料,准备改天发一套分化实验图来给大家参考。
欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)
Powered by Discuz! X1.5