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标题: mES制备EB照片 [打印本页]

作者: yaoyaoyatou 时间: 2010-7-15 21:20 标题: mES制备EB照片

大家好！第一次制备EB，感觉很失败，不知道原因在哪里？希望大家能给我指点一下。
我的EB培养基是：KO-DMEM, FBS,L-glu, NEAA, Pen-strep,meraptoethanol.9 }) \2 W& \: x9 Y7 z7 W
mES 的大概是10W/mL
方法一：20ul的小滴滴在皿盖上，倒扣在皿底，培养48hr， EB如照片所示，EB边界不清楚，形态不圆，分化严重。+ N3 x7 B6 U1 {
方法二：将mES悬浮培养在细菌培养皿内，48hr后换液，EB状态同方法一差不多。' z/ z8 y5 D9 F* A( d6 k1 A+ [
请大家看看我的步骤有什么不妥的吗？给予指点。
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作者: yaoyaoyatou 时间: 2010-7-15 21:23

补张照片. Z7 _9 f+ P+ Z" F
[attach]10616[/attach]

作者: 痞子的烟头 时间: 2010-7-15 21:40

作EB之前一定要保证MES或HES状态要好，至于培养基LIF以外，其它都成份都一样
还有消化作EB时，不要太过了，

作者: xjya 时间: 2010-7-15 21:50

对于方法一，悬滴法，细胞密度一般是20000-40000/ml.小鼠培养基一般20%FBS的高糖含L-glutamin的DMEM。48小时后收集EB的时候要特别小心，用蓝色枪头收集，注意不要反复吹打，以免打散EB。
对于方法2，你是想用mass culture法吧。这个方法细胞密度一般是1000000/ml.但是要在摇床上不停的摇才行，48小时后稀释成1000个EB/皿，继续摇，直到相应的时间。# t2 v" y) Y/ O6 f8 C; s
从你的图中看，大概是吹的太狠了，EB都散架了。
还有一点我不明白，你觉得“EB边界不清楚，形态不圆，分化严重”，为什么说分化严重啊？好像这么说不妥~

作者: wangzhuo822001 时间: 2010-7-15 21:53

关注～～～

作者: xiaojunhu1985 时间: 2010-7-15 22:42

原因
一：小鼠的ES 状态本身就不好。, c# F2 ^! U$ o
二：做好不要用FBS 培养，很容易贴壁。要使用血清替代物。SR

作者: xiaojunhu1985 时间: 2010-7-15 22:42

这个问题我也遇过。尤其是在ES 状态不好的情况下

作者: 双刀 时间: 2010-7-16 11:04

ES细胞的状态很重要，另外的就是，楼主用的FBS用的是哪个牌子的

作者: wangzhuo822001 时间: 2010-7-17 09:10

你说的方法二，是不是先由方法一悬滴培养两天，然后再悬浮培养？

作者: yaoyaoyatou 时间: 2010-7-17 15:57

方法二是直接将ES吹散后悬浮在分化培基里，在细菌培养皿里悬浮培养，48hr后EB很小。比方法一EB要小很多。至于mES状态还是不错的。但是很奇怪EB为什么总是这个状态。

作者: 梦想lab 时间: 2010-7-31 18:09

ES状态好的话，形成的EB才能好。我用第二种悬浮做过，48hrs观察，发现还是比较均匀的，我种的细胞没那么多

作者: erikoapril 时间: 2010-10-11 00:40

可以尝试增加每个液滴的细胞数试试看

作者: henryjia 时间: 2010-10-11 18:32

除上述意见之外，如果仔细观察补充的第三张图，可以清晰地发现很多游离的细胞，且形态大小不规则 - 这是明显的细胞死亡征兆。ES细胞是非常敏感脆弱的，在收获过程中，很多因素可以影响：1，消化酶消化时间，2，离开incubator时间，保温状况。* ^- _, o. f% C3 a$ R1 k9 r

此外，你所说的‘mES状态还是不错的’ - 是否指形态观察？这往往是不充分的。定期的characterisation 很重要。

作者: henryjia 时间: 2010-10-11 22:02

补充一点，LZ说EB‘分化严重’ - 这不准确，因为生成EB的目的就是要诱导ES开始分化。
$ C' J) O# Y- n8 n; L
我正在整理以前做的HES分化实验资料，准备改天发一套分化实验图来给大家参考。

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