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标题: mES制备EB照片 [打印本页]

作者: yaoyaoyatou 时间: 2010-7-15 21:20 标题: mES制备EB照片

大家好！第一次制备EB，感觉很失败，不知道原因在哪里？希望大家能给我指点一下。4 n: `3 h( H. W4 m" r7 O8 _8 E
我的EB培养基是：KO-DMEM, FBS,L-glu, NEAA, Pen-strep,meraptoethanol.
mES 的大概是10W/mL
方法一：20ul的小滴滴在皿盖上，倒扣在皿底，培养48hr， EB如照片所示，EB边界不清楚，形态不圆，分化严重。
方法二：将mES悬浮培养在细菌培养皿内，48hr后换液，EB状态同方法一差不多。7 s5 e. R* p( H$ J
请大家看看我的步骤有什么不妥的吗？给予指点。* x! ?# D" |* K) \- w7 ]
[attach]10613[/attach]3 _7 {' Z9 D8 o7 B% S
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作者: yaoyaoyatou 时间: 2010-7-15 21:23

补张照片
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作者: 痞子的烟头 时间: 2010-7-15 21:40

作EB之前一定要保证MES或HES状态要好，至于培养基LIF以外，其它都成份都一样
还有消化作EB时，不要太过了，

作者: xjya 时间: 2010-7-15 21:50

对于方法一，悬滴法，细胞密度一般是20000-40000/ml.小鼠培养基一般20%FBS的高糖含L-glutamin的DMEM。48小时后收集EB的时候要特别小心，用蓝色枪头收集，注意不要反复吹打，以免打散EB。8 X r, c) a5 S; e" H6 X% e5 ^
对于方法2，你是想用mass culture法吧。这个方法细胞密度一般是1000000/ml.但是要在摇床上不停的摇才行，48小时后稀释成1000个EB/皿，继续摇，直到相应的时间。" y w' g9 P( O. }
从你的图中看，大概是吹的太狠了，EB都散架了。) [$ ~/ Q8 p; ]6 |1 F# ~) a
还有一点我不明白，你觉得“EB边界不清楚，形态不圆，分化严重”，为什么说分化严重啊？好像这么说不妥~

作者: wangzhuo822001 时间: 2010-7-15 21:53

关注～～～

作者: xiaojunhu1985 时间: 2010-7-15 22:42

原因
一：小鼠的ES 状态本身就不好。7 d; @ _# O$ f: D
二：做好不要用FBS 培养，很容易贴壁。要使用血清替代物。SR

作者: xiaojunhu1985 时间: 2010-7-15 22:42

这个问题我也遇过。尤其是在ES 状态不好的情况下

作者: 双刀 时间: 2010-7-16 11:04

ES细胞的状态很重要，另外的就是，楼主用的FBS用的是哪个牌子的

作者: wangzhuo822001 时间: 2010-7-17 09:10

你说的方法二，是不是先由方法一悬滴培养两天，然后再悬浮培养？

作者: yaoyaoyatou 时间: 2010-7-17 15:57

方法二是直接将ES吹散后悬浮在分化培基里，在细菌培养皿里悬浮培养，48hr后EB很小。比方法一EB要小很多。至于mES状态还是不错的。但是很奇怪EB为什么总是这个状态。

作者: 梦想lab 时间: 2010-7-31 18:09

ES状态好的话，形成的EB才能好。我用第二种悬浮做过，48hrs观察，发现还是比较均匀的，我种的细胞没那么多

作者: erikoapril 时间: 2010-10-11 00:40

可以尝试增加每个液滴的细胞数试试看

作者: henryjia 时间: 2010-10-11 18:32

除上述意见之外，如果仔细观察补充的第三张图，可以清晰地发现很多游离的细胞，且形态大小不规则 - 这是明显的细胞死亡征兆。ES细胞是非常敏感脆弱的，在收获过程中，很多因素可以影响：1，消化酶消化时间，2，离开incubator时间，保温状况。

此外，你所说的‘mES状态还是不错的’ - 是否指形态观察？这往往是不充分的。定期的characterisation 很重要。

作者: henryjia 时间: 2010-10-11 22:02

补充一点，LZ说EB‘分化严重’ - 这不准确，因为生成EB的目的就是要诱导ES开始分化。
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我正在整理以前做的HES分化实验资料，准备改天发一套分化实验图来给大家参考。

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