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标题: 求助，原代神经干细胞的具体步骤。 [打印本页]

作者: xfyang2007123 时间: 2010-7-20 10:18 标题: 求助，原代神经干细胞的具体步骤。

各位仁兄，我最近在做神经干细胞的原代取材。不知是取材步骤的问题还是所用动物为幼年大鼠不是胎鼠的问题，总之所取的效果不满意。而且里面的杂质非常多，一天不换液就很浑浊。所以想求助各位，有谁取原代神经干细胞成功的话，能不能将您的实验步骤（具体的）发上来看看，也供大家学习学习。因为神经干细胞是所有细胞中比较难养的细胞之一，所以包括换液什么的总是感觉很头疼，例如：大家是不是都离心后换液呢？传代时是直接取半量的培养基还是离心后重新换培养基？。再就是大家传代是物理吹打还是胰酶消化？等等，我感觉有很多问题还不是很清楚，所以想请教各位，尤其是已经成功培养神经干细胞的同仁们。谢谢！

作者: rhmm 时间: 2010-7-20 20:01

一般来说，胎鼠效果较理想，而且与你取得部位有关，至于换页要看细胞生长状况，要是状态不好的话，随时加生长因子，要是好的话就隔天全量换页

作者: xfyang2007123 时间: 2010-7-20 22:08

回复 2# rhmm 7 f e/ |9 d" h% O
谢谢了。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-7-21 19:03

怎么没人发取原代的方法呢？是不是都是买的细胞啊？

作者: jennyshy 时间: 2010-7-25 13:43

原代方法步骤，文章中有好多，就不多说了，我这里就说一点要点的东西：一是取材的部位要准确，比如海马区；二是取的组织不能粘附血丝一些的东西，会导致后续培养出现成纤维细胞或者培养的细胞很脏，而且也比较难除去；三是将组织打散或者消化再吹到成单细胞的手法要轻柔，不要弄出很多泡沫，吸管或者用枪吹都需要抵住管底部，剪切力大效果也好；四是细胞种植的密度一定要把握好，太密太稀结果都不好。6 { [' S& L1 V2 ]" v" O& U: `1 P
1 W2 F$ A) v& t/ B3 E8 I
干细胞原代不太好养，多多练习，多多积累经验……我以前也失败过好多次，慢慢熟悉这细胞的特性就好了。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-7-26 18:23

回复 6# jennyshy 0 D/ G) k& |' ? f0 M' d
谢谢指点。我取神经干细胞时就是按照一些论文上的方法取的，但是效果不好。而且至今我都不知道怎么除去里面的杂质，主要是小血管和组织片，因为神经干细胞球和杂质都是悬浮的。请问你们取得时候有杂质吗？又是怎么去除的呢？

作者: jennyshy 时间: 2010-7-26 23:06

回复 7# xfyang2007123 & m% G* O! J: q5 g6 z6 F
, m. \. e# L4 [& t( f* \% H7 B
幼年鼠比胎鼠杂质多，除了取材时要尽量弄干净些，还有就是过过筛网，再就是半量换液去除一部分杂质，不能一点都没有。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-7-27 21:05

回复 8# jennyshy 5 y" G; ~: _7 v1 ? B
看来我得改进我的方法了，继续努力了，呵呵。

作者: huangfei2010 时间: 2010-7-28 14:46

回复 8# jennyshy

8 }7 |: C: i0 M
请教一下啊，胎鼠不都是直接取脑组织吗，好像分不清脑组织的具体结构啊

作者: xfyang2007123 时间: 2010-7-29 08:43

回复 10# huangfei2010 [/b了。看文献上胎鼠多是在解剖显微镜下取组织，不用显微镜的话估计就很难分出是那一部分
作者: SVZ 时间: 2010-7-29 13:22

以下建议，仅供参考：) L& O) |$ \2 g T3 S" `( L
1。关于小血管：建议取材时一定要在显微镜底下仔细将脑膜和血管剔除干净5 I. k6 b3 I7 u
2。关于组织片：建议用200目细胞筛过滤。也可用200目，400目双重过滤。
3 V1 l! |0 P2 N- e3 }! l6 x3。传代换液建议半量换液，据文献报道全量换液易致分化。
作者: xfyang2007123 时间: 2010-7-30 08:26

回复 12# SVZ
* ~& K3 y- V! G现在知道为什么半量换液了，原以为是怕细胞环境改变太快，适应不了呢。谢谢了。
作者: jennyshy 时间: 2010-8-2 11:04

回复 10# huangfei2010
8 h+ x! c0 H% s/ h6 x5 O1 M: j& z% U! P! ~. l0 |# h$ S* U
) ~* t! }5 |, e& L( ?, o3 l
是可以分清楚间脑一些东西的，16d的海马都可以看清楚的。我用14d的，只取了大脑皮层，中间的一些东西都去掉了。0 e6 C; I/ X7 P( M+ u8 z
胎鼠脑比较软，解剖时要耐心，慢慢来，否则就一片模糊了……
作者: jennyshy 时间: 2010-9-20 21:47

回复 10# huangfei2010
0 f; g" w: w% ^' {6 z
7 m* b0 w: j6 z, Q6 L/ u' T0 ~8 l6 H9 Q% F3 F, V
16d的大鼠胎脑的海马是可以看到的，也可以分离出来，我用肉眼分的，其他的部分我就看不很清楚，但是海马是可以看到的，而且小心取也能分得很完整。14、15d的胎脑，去掉间脑等等，把皮层留下就可以了，呵呵宁缺勿滥，4 }( I4 |9 `/ A/ S: W
也有文献说把整个脑扔进去养NSCs的，不过只取14d胎鼠的皮层养，个人认为中脑内一些神经元会混入到你养的细胞里。

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