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标题: 肝细胞癌中卵圆细胞表面标记的表达及意义 [打印本页]

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作者: 文献管理员    时间: 2009-3-3 12:03     标题: 肝细胞癌中卵圆细胞表面标记的表达及意义

作者：颜政  周为  方驰华作者单位：(1.青海大学附属医院肿瘤外科；2.南方医科大学珠江医院肝胆外科) ( `9 x: [6 B+ g
                  
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) d1 i+ u/ l8 p3 R5 c) ?, h        . r0 C! J" A9 T2 M
        
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          【摘要】  目的  探讨卵圆细胞部分表面标记在肝细胞癌中的表达状况和意义。方法  应用免疫组织化学SABC法检测20例肝细胞癌中CK7、CK19、CK18、CD34、c-kit 抗原的表达。结果  14例肝细胞癌CK7表达呈阳性，其阳性表达率为70%(14/20)；9例c-kit 的阳性表达率为45%(9/20)；在20例肝细胞癌癌组织中的CK18全部呈阳性表达，CK19和CD34全部呈阴性表达。CK7、c-kit表达与患者年龄、性别无关，与肿瘤大小、是否合并肝硬化以及组织学分级也不相关(P﹥0.05)。结论  肝细胞癌癌组织中存在表达卵圆细胞表面标记的细胞，其表达CK7、c-kit，不表达造血干细胞标记物CD34。其进一步提示，肝细胞癌可能不是起源于肝干细胞而是来源于过渡性的前体细胞/祖细胞，如来源于Hering管的卵圆细胞。  颜政（1963～），男，汉族，湖南籍，副主任医师,博士 1 U7 E8 ]0 L6 v8 J! `9 i8 u
          【关键词】卵圆细胞  表面标记  肝细胞癌  肝脏干细胞, l4 ~! \- e$ e  b
                  EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF SURFACE
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MARKERS OF OVAL CELLS IN HEPATIC CELLUL
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9 o3 W: Z: U5 X' X# [( m7 o) `/ AAR CARCINOMA
: Z, h# o( d  C+ {- M% i0 M2 g# O: s) V% \
- `$ I1 W) i$ @8 n# }Yan Zheng1，Zhou Wei1，Fangh Chihua2
# c6 n1 {/ g: z4 _( U6 w8 T& W1 E) {1 d: M* o
* h  q: Q) L1 V% c（1.Department of Tumor Surgery, Qinghai University Affiliated Hospital;
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2.Department of General Surgery,Zhujiang Hospital, The Southern Medical University）
, [# }9 l5 P" b. Q; z$ l. K, T
1 b' C+ {: ?- y$ uAbstractObjectiveTo identify the expression of surface markers on oval cells and explore its implications in hepatic cellular carcinoma(HCC). MethodsSurface markers of oval cells (CK7, CK18, CK19, CD34 and c-kit)antigen was tested using histochemical method (SABC) in 20 cases with hepatic cellular carcinoma. ResultsExpression of CK18 was positive in all 20 hepatic cancer samples. Expression of CK19 was not observed in all hepatic cancer samples except in the sample of epithelial cell of small bile duct and expression of CD34 was not observed in all hepatic cancer samples. CK7 expression was positive in 14 HCC samples (14/20, 70%) and c-kit expression was positive in 9 samples (9/20, 45%). Expression of CK7 and c-kit were not found in 4 samples of parenchyma cells of normal hepatic tissues. The expression of CK7 and c-kit is not related to the age, gender of patients, neither to compilation of hepatocirrhosis or histological classification (P>0.05). Conclusion In HCC tissues, there are cells that can express surface markers of oval cells. These cells can express CK7 and c-kit, but cannot express CD34, the marker of hematopoietic stem cell. This suggests that HCC may not be originated by hepatic stem cell, but rather by transitional progenitor cell, such as the oval cell originated from Hering duct." D7 z$ }2 P2 k
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Key wordsOval cellSurface markerHepatic cellular carcinomaHepatic stem cell
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目前，有关肝细胞癌的细胞源研究取得了较大进展，已有实验提示肝内卵圆细胞在致癌因素的作用下可向癌细胞异常分化，已经有不少学者从肝癌组织中发现了卵圆细胞(Oval cell,OVC)的存在［1，2］。但原发性肝癌是否来源于肝卵圆细胞成熟受阻的过程还未有定论，因此没有肝卵圆细胞发展为原发性肝癌的直接证据。肝卵圆细胞是肝干细胞的子代，被认为是由干细胞分化而来，具有双向分化潜能，既可分化为肝细胞，也可分化为胆管上皮细胞，具有一过性地表达肝细胞和胆管细胞的特性。因此，卵圆细胞既部分表达“肝细胞型”CK组型CK8和CK18，还表达“胆管型”CK组型CK7和CK19。许多学者提出上述特性甚至可以在肝细胞性肝癌(Hepatic Cellular Carcinoma,HCC)及胆管细胞性癌（Intrahepatic Cholanglo Carcinoma, ICC）中得到保持。然而，目前对此认识尚未统一。假设肝细胞癌来源于肝脏干细胞，我们拟利用免疫组织化学研究方法检测肝脏干细胞部分表面标记在肝细胞癌癌组织中的表达，探索肝细胞癌卵圆细胞可能的起源。8 I5 M+ W! m. U

2 w' z& `- A. x; B1材料与方法, v" p" q- j# I; L

" W" M$ d% Q, w' c, b1.1材料3 O% [! d% H% c# p2 ]2 C+ X. N

9 }0 ^8 p1 j# i$ Y& D+ h1.1.1病理组织6 P5 Z; K) q+ G- ]  {! I: U

3 Y0 n* n+ g" _2 W; a# a7 I+ E7 L2 j20例肝细胞癌组织及4例正常肝脏标本均取自南方医院外科。肝细胞癌为主要研究对象，取正常肝组织作正常对照。肝癌组织标本均在患者首次手术时从肝内取材（所有病人术前均未行化疗和放疗），主要观察肿瘤组织和癌旁组织。所有组织用10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，切片(4μm)备用。
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1.1.2主要试剂! Y: v' `6 j6 c# g& g3 u, s% q' P4 D2 g. M

5 n) M3 u# }$ O; q, _第一抗体是鼠抗人CK7IgG 、CK19 IgG、CK18 IgG、CD34 IgG、c-kit IgG，由北京中山生物公司提供，稀释比例为1:100；正常山羊血清封闭液为武汉博士德生物公司产品。第二抗体免疫组化检测试剂及显色剂DAB为北京中山生物公司产品。
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1.2实验方法
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' p2 Y& l9 Y) c; ]( J6 O标本常规脱蜡、水化。PBS洗涤(5 min2次)，用3 % H2O2 阻断内源性过氧化酶，用微波修复抗原，PBS洗涤（2min3次），滴加羊血清封闭液，室温下孵育10 min；滴加一抗IgG，37℃水浴孵育2 h， PBS洗涤（2min3次），滴加生物素二抗羊抗鼠IgG，37℃水浴孵育20min；PBS洗涤（2min3次），滴加试剂SABC，37℃水浴孵育20 min，PBS洗涤（2min3次），DAB显色；苏木素轻度复染50s，经脱水、透明处理后用中性树脂封片，待镜下观察。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知c-kit 和CD34表达呈阳性的胃肠道间质瘤组织作阳性对照，细胞浆和(或)细胞膜呈棕黄色为阳性染色。取5个有代表性的高倍镜视野，观察100个细胞并计算阳性细胞数，平均阳性细胞数>10%为阳性。
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0 N5 b7 B0 _/ ?( W) H$ W! }5 Z1.3统计学处理  r% B* v+ G& ^2 G' m- T5 }
: e6 \; A% e  g4 T7 o
应用SPSS10.0软件进行统计处理。组间患者的年龄比较应用独立样本t检验；各组间比较采用两独立样本秩和检验或Fisher's精确概率检验；P
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8 x. n; G4 ]" u. e1 @2结果4 n  A; r7 f" [; g. k6 T
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2.1临床病理特征6 u& @8 m! e7 `) U3 h, O" y+ k8 Q
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20例肝细胞癌组织均经术后病理确诊，其中高分化癌4例，中分化癌12例，低分化癌4例。20例患者中，男性15例，女性5例；合并肝硬化者10例，肿瘤直径大于3 cm 者12例（表1）。切片经苏木精-伊红染色后在光镜下观察，癌细胞胞浆呈嗜伊红性，核深染色大小不等，多见核分裂相。5 R1 i' g. x! m# j# j

; H0 B2 b- ~2 J7 u2.2免疫组化结果
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; [8 ?' H: {* }3 A在20例肝细胞癌组织中CK18表达均呈阳性，CK18表达于细胞浆及细胞膜，呈棕黄色，CK18表达阳性细胞呈弥漫性分布（图1）。在20例肝细胞癌组织细胞中，除了在小胆管上皮表达CK19外，没有1例肿瘤细胞表达CK19（图2）。正常肝组织的肝细胞表达CK18，胆管上皮表达CK19。
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CK7 多表达于细胞浆，颜色为棕黄（图3）。CK7 阳性细胞呈点状、片状分布，或呈弥漫性分布，可以位于癌组织中央区域，也可以位于癌结节的外缘；还可见到较肿瘤细胞小，而形态呈卵圆形的CK7表达阳性细胞分布在癌结节外，其细胞核大，胞质少，核浆比高 (图4)。表1显示，14例肝细胞癌CK7表达阳性，表达率为70%(14/20)，在4例正常肝脏的实质细胞内未见CK7表达，CK7表达与患者年龄、性别无关，与肿瘤大小、是否合并肝硬化以及组织学分级也不相关(P﹥0.05)，见表2。表120例肝细胞癌病人临床病理特征3 U6 u- d5 |; s3 |7 R! a8 `

5 z( _- f; ~  w3 ?- l6 dc-kit表达于细胞质与细胞膜，阳性染色者为棕黄色细颗粒状，阳性细胞呈散在或片状分布，在癌结节的外围可见到黄染的小卵圆细胞（图5）。9例表达c-kit，阳性率为45%(9/20)；在4 例正常肝组织实质细胞内未见c-kit 表达。此外，c-kit 表达与患者年龄、性别无关，与肿瘤大小、是否合并肝硬化以及组织学分级也不相关(P﹥0.05)，详细结果见表3。
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, q2 @9 b8 J$ H3 W2 i" T' T在20例肝细胞癌组织中， 除毛细血管上皮表达CD34外，没有1例肿瘤细胞表达CD34。表2肝细胞癌CK7 免疫组化和临床病理特征
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3 Q3 \: X4 Q) ~3讨论6 q% ~$ o" D8 g  |- m, y/ V8 h

: j: E7 {& ?+ ?通常正常肝细胞表达肝细胞型表面标记CK18、CK8［3,4］，而胆管细胞表达胆管型的表面标记CK7，CK19［3～5］。许多学者提出上述差别甚至可以在HCC及胆管细胞性癌ICC中得到保持。因此，CK组型曾被用作肝癌分型的一种标志。然而，目前对此还存在争议，有学者对HCC进行石腊切片和免疫组织染色，发现其内含有CK19 异常表达的癌细胞［6］。另有学者认为HCC来源于一种能表达“胆管型”CK的细胞［7］，因此认为肝细胞特异性表型在肿瘤发生过程中并不总是保持不变［8］。而我们的研究发现，所有样本肝细胞癌组织都表达CK18，部分表达CK7，不表达CK19，部分支持上述观点，提示肝癌可能来源于一种能表达“胆管型”CK的细胞。
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卵圆细胞是肝干细胞的子代，一般认为位于小叶胆管和 Hering 管道中，具有双向分化潜能，既可分化为肝细胞，也可分化为胆管上皮细胞［9］，因此肝脏祖细胞表达胆管上皮和肝细胞标记。从个体发生来看，肝干细胞分化的不同时期表达不同的标记。在人类妊娠8～14周，肝内具有双向分化潜能的干细胞可能为CK14和CK19双阳性细胞，随后向胆管上皮分化者其CK19表达增强，而CK14表达消失。孕期第7～9 周，肝门附近门静脉大分支周围出现一些对CK8 、CK18 和CK19的免疫反应明显增强的增殖细胞，在孕期9周以后进化为“胆管极”并逐渐分布于整个肝脏，孕12周时“胆管极”逐渐改建成单个的小叶内胆管，孕20 周以后“胆管极”细胞开始对CK7 产生免疫反应，意味着这群细胞出现了与正常成人肝内胆管上皮细胞相似的一组多肽。后来的研究也证实了同样的过程［10］。因此，通过观察肝细胞和胆管细胞标记的共同表达，我们可以推测HCC起源于肝脏干细胞或前体细胞/祖细胞［11,12］。- }7 Q" R9 X+ ~

- g) [, X& I: R在肝卵圆细胞和造血干细胞上部分表达相同的细胞表面标记，在啮齿类动物有c-kit、CD34以及Thy-1，在人类共同表达c-kit和CD34［13，14］。因此有学者推测，至少部分卵圆细胞起源于骨髓干细胞［15］。肝干细胞可以通过检测共同表达肝细胞型表面标记（CK18或CK8）、胆管细胞表达胆管型的表面标记（CK19或CK7）以及造血干细胞表面标记（CD34、c-kit）确定［13～15］。
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c-kit是人类原癌基因，编码跨膜酪氨酸激酶的受体(CD117)。c-kit主要在肥大细胞、定向造血干细胞、肝干细胞和一些肿瘤细胞中表达。对暴发性肝衰竭和正常肝组织表达肝干细胞因子及其受体(SCF/c-kit)的研究显示，SCF/c-kit系统的表达与肝损伤后的修复有关，c- kit阳性细胞可能就是肝内特异性干细胞团［14］。CD34是一种重糖化I型跨膜蛋白，在最早的造血祖细胞上高水平表达，当成熟的血细胞失去形成克隆的能力时，表面表达则减低到检测不出的水平。CD34在除血窦内皮细胞以外的所有小血管内皮细胞中均表达，且还可以在组织干细胞（如肝干细胞）［16，17］中表达。
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肝干细胞表达c-kit和CD34 ［14～16］，但是在Hering管细胞中c-kit阳性的细胞CD34呈阴性表达［18］，其可能是肝细胞的前体细胞/祖细胞。我们通过免疫组化法研究了肝细胞癌中c-kit和CD34的表达。在研究中有45%(9/20)的肝细胞性肝癌表达c-kit，而CD34则无表达。c-kit阳性而CD34无一例阳性提示，HCC可能不是起源于肝干细胞而是来源于过渡性的前体细胞/祖细胞，如来源于Hering管的卵圆细胞。c-kit的表达与血管内皮细胞迁移有关，有可能促进新血管的形成；也有可能增加酪氨酸激酶的活性，导致新生血管的形成而促进肿瘤的生长［19］。
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CK7是胆管型细胞角蛋白，通常表达于胆管上皮细胞，而不表达于肝细胞［20 ,21］，正如本研究所显示的实验结果。但是，在一定病理生理条件下，细胞角蛋白可以发生表达异常［22］。我们观察到70%（14/20）的肝细胞性肝癌表达CK7，提示在肝细胞增殖和癌变过程中，细胞表型发生了改变。这也为探索原发性肝癌的细胞起源提供了线索。目前认为肝干细胞是一种位于肝脏汇管区的卵圆细胞，可以表达CK7。在致癌环境作用下可异常分化形成肝细胞癌和胆管细胞癌［23］。实验观察到部分肝癌细胞表达CK7，符合肝干细胞在分化过程中的前体干细胞表型变化定位，表明卵圆细胞具有向上皮分化的潜能，只是当分化为正常肝细胞时，表达CK7的表型被抑制，当肝细胞癌变时就可表现出干细胞的某些表型，如表达CK7。6 f6 q* s# Y3 W# b: p7 p+ k" M% p

& _4 P+ \% L8 Q. M1 D2 [2 F+ J$ M0 @% f总之，在肝细胞癌组织中存在表达卵圆细胞表型标记的未成熟细胞。表达CK7、c-kit，而不表达CD34，提示这些细胞可能不是来源于肝干细胞，而是来源于过渡性的前体细胞（如来源于Hering管的细胞）。由于我们只选用了部分卵圆细胞表面标记用于研究，CK7 、c-kit＋、CD34－可能只代表了部分前体干细胞在肝癌组织中表达的表型，而本实验没有对肝干细胞表型Thy-1进行研究，因而对肝肿瘤中全面的干细胞表型还需进一步研究。
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作者: 我心飞翔    时间: 2015-6-1 16:43

好人一个  

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作者: 泡泡鱼    时间: 2015-6-18 15:27

这个站不错！！  

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作者: 罗马星空    时间: 2015-8-19 21:16

支持你一下下。。  

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作者: 陈晴    时间: 2015-9-8 16:43

干细胞库  

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作者: aakkaa    时间: 2015-9-20 08:05

真是有你的！  

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作者: 剑啸寒    时间: 2015-9-22 19:54

楼主也是博士后吗  

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作者: nauticus    时间: 2015-9-23 17:57

造血干细胞

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作者: 依旧随遇而安    时间: 2015-9-30 05:25

今天临床的资料更新很多呀

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作者: immail    时间: 2015-10-22 22:18

楼主good  

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作者: haha3245    时间: 2015-11-3 16:10

一楼的位置好啊..  

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作者: MIYAGI    时间: 2015-12-3 23:09

鉴定完毕.!  

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作者: haha3245    时间: 2016-1-5 07:24

都是那么过来的  

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作者: s06806    时间: 2016-1-16 02:28

正好你开咯这样的帖  

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作者: beautylive    时间: 2016-1-29 08:43

希望大家帮我把这个帖发给你身边的人，谢谢！  

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作者: 安生    时间: 2016-2-21 13:39

感觉好像在哪里看过了，汗~  

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作者: dmof    时间: 2016-3-13 11:18

只有一条路不能选择——那就是放弃的路；只有一条路不能拒绝——那就是成长的路。  

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作者: 三星    时间: 2016-4-21 19:10

自己知道了  

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作者: 若天涯    时间: 2016-4-25 14:35

哈哈 瞧你说的~~~  

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作者: Diary    时间: 2016-5-9 16:27

楼上的话等于没说~~~  

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作者: 张佳    时间: 2016-5-18 21:08

来几句吧  

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作者: whyboy    时间: 2016-5-24 08:35

呵呵，等着就等着....  

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作者: 某某人    时间: 2016-6-3 14:44

支持你就顶你  

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作者: tian2006    时间: 2016-6-6 13:59

初来乍到，请多多关照。。。  

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作者: chinagalaxy    时间: 2016-7-14 22:18

不早了 各位晚安~~~~  

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作者: 知足常乐    时间: 2016-8-12 22:27

内皮祖细胞

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作者: na602    时间: 2016-8-31 16:01

支持你就顶你  

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作者: 丸子    时间: 2016-9-15 12:15

做一个,做好了,请看  

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作者: heart10    时间: 2016-9-19 12:01

支持你就顶你  

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作者: hmhy    时间: 2016-10-15 07:35

彪悍的人生不需要解释。  

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作者: IPS干细胞    时间: 2016-11-13 11:19

支持一下吧  

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作者: 与你同行    时间: 2016-12-2 14:10

不管你信不信，反正我信  

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作者: 草长莺飞    时间: 2016-12-10 11:43

很好！很强大！  

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作者: 8666sea    时间: 2016-12-13 13:18

天啊. 很好的资源

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作者: Greatjob    时间: 2017-1-2 05:40

必须顶  

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作者: chinagalaxy    时间: 2017-1-3 19:24

不是吧  

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作者: 若天涯    时间: 2017-1-10 22:35

小心大家盯上你哦  

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作者: ikiss    时间: 2017-2-4 14:35

一个人最大的破产是绝望，最大的资产是希望。  

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作者: biobio    时间: 2017-2-8 12:27

不是吧  

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作者: 初夏洒脱    时间: 2017-2-10 16:27

一楼的位置好啊..  

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作者: 兔兔    时间: 2017-3-6 19:04

楼主也是博士后吗  

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作者: feixue66    时间: 2017-3-13 23:18

呵呵 高高实在是高~~~~~  

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作者: chinagalaxy    时间: 2017-3-31 09:35

说的不错  

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作者: 化药所    时间: 2017-4-17 08:32

我等你哟!  

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作者: 分子工程师    时间: 2017-4-22 20:20

严重支持！

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作者: 昕昕    时间: 2017-5-6 07:06

天啊. 很好的资源

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作者: 命运的宠儿    时间: 2017-5-13 06:18

顶你一下.  

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作者: 王者之道    时间: 2017-5-14 07:02

既然来了，就留个脚印  

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作者: 碧湖冷月    时间: 2017-6-4 20:27

爷爷都是从孙子走过来的。  

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作者: ringsing    时间: 2017-6-9 01:44

不看白不看，看也不白看  

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作者: 蝶澈    时间: 2017-6-12 16:10

说的不错  

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作者: lab2010    时间: 2017-6-26 09:43

长时间没来看了 ～～  

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作者: renee    时间: 2017-6-27 10:27

给我一个女人，我可以创造一个民族；给我一瓶酒，我可以带领他们征服全世界 。。。。。。。。。  

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作者: 旅美学者    时间: 2017-7-1 11:43

设置阅读啊  

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作者: lab2010    时间: 2017-8-2 11:42

做一个,做好了,请看  

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作者: lab2010    时间: 2017-8-4 20:27

间充质干细胞

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作者: HongHong    时间: 2017-8-11 19:25

你加油吧  

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作者: vsill    时间: 2017-9-25 04:01

看看..  

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作者: marysyq    时间: 2017-10-4 18:27

你还想说什么啊....  

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作者: 苹果天堂    时间: 2017-10-5 19:36

一楼的位置好啊..  

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作者: 碧湖冷月    时间: 2017-10-8 03:46

干细胞治疗  

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作者: nosoho    时间: 2017-10-28 06:24

这年头，分不好赚啊  

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作者: dypnr    时间: 2017-11-18 01:30

经过你的指点 我还是没找到在哪 ~~~  

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作者: bluesuns    时间: 2017-11-27 20:17

呵呵 大家好奇嘛 来观看下~~~~  

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作者: 橙味绿茶    时间: 2017-12-10 05:51

哎 怎么说那~~  

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作者: 老农爱科学    时间: 2017-12-15 21:53

顶顶更健康，越顶吃的越香。  

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作者: 黄山    时间: 2018-1-29 23:20

胚胎干细胞

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作者: vsill    时间: 2018-2-9 11:52

哎 怎么说那~~  

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作者: myylove    时间: 2018-2-19 03:22

肿瘤干细胞

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作者: na602    时间: 2018-2-23 10:18

内皮祖细胞

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作者: DAIMAND    时间: 2018-2-28 14:10

病毒转染干细胞

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作者: biopxl    时间: 2018-3-6 07:53

在线等在线等  

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作者: na602    时间: 2018-3-9 02:10

希望大家帮我把这个帖发给你身边的人，谢谢！  

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作者: biobio    时间: 2018-4-5 01:12

谢谢干细胞之家提供资料

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作者: 黄山    时间: 2018-5-12 19:08

干细胞我这辈子就是看好你

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作者: 老农爱科学    时间: 2018-5-22 02:25

这贴？不回都不行啊  

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作者: 8666sea    时间: 2018-5-28 17:18

晕死也不多加点分  

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作者: 咕咚123    时间: 2018-5-29 22:24

哎 怎么说那~~  

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作者: 刘先生    时间: 2018-6-4 11:35

似曾相识的感觉  

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作者: 丸子    时间: 2018-6-13 12:54

拿分走人呵呵，楼下继续！

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作者: 咕咚123    时间: 2018-7-20 06:16

应该加分  

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作者: aliyun    时间: 2018-8-1 00:13

勤奋真能造就财富吗？  

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作者: vsill    时间: 2018-8-28 09:35

哦...............  

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作者: nosoho    时间: 2018-9-20 02:54

先看看怎么样！  

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作者: awen    时间: 2018-10-29 07:27

人之所以能，是相信能。  

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作者: 石头111    时间: 2018-11-20 02:51

希望可以用些时间了~````  

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作者: dreamenjoyer    时间: 2018-12-16 07:54

一楼的位置好啊..  

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作者: popobird    时间: 2018-12-18 11:18

不错 不错  比我强多了  

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作者: 生科院    时间: 2019-1-1 14:10

一楼的位置好啊..  

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作者: DAIMAND    时间: 2019-1-5 20:09

羊水干细胞

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作者: keanuc    时间: 2019-1-8 13:18

小生对楼主之仰慕如滔滔江水连绵不绝,海枯石烂,天崩地裂,永不变心.  

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作者: 昕昕    时间: 2019-1-31 22:45

病毒转染干细胞

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作者: 黄山    时间: 2019-2-11 13:01

我在努力中  

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作者: immail    时间: 2019-2-19 22:45

挺好啊  

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作者: dongmei    时间: 2019-4-12 22:10

帮顶  

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作者: 龙水生    时间: 2019-4-26 11:01

设置阅读啊  

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作者: 丸子    时间: 2019-4-29 15:01

今天没事来逛逛，看了一下，感觉相当的不错。  

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作者: 一个平凡人    时间: 2019-5-14 10:35

照你这么说真的有道理哦 呵呵 不进沙子馁~~~  

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作者: happyboy    时间: 2019-5-23 16:58

做一个,做好了,请看  

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作者: dglove    时间: 2019-6-26 01:21

帮你项项吧  

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