干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: u6启动子的问题 [打印本页]

---

作者: hndxws    时间: 2010-7-24 19:52     标题: u6启动子的问题

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。& a$ g6 @) X- g. b# y* B; M
有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

---

作者: ambassador    时间: 2010-7-25 16:58

. {8 Q1 p, H- T% I# Z4 N$ y

+ w; D  F0 ^4 o$ y" h: }5 k你的这个问题具体怎么解决我不太清楚，不过你上面的“有人说，U6启动时有固定的转录起始位点”，这个不要亲信他人说法，看看这个文献，对你一定有帮助：3 `8 I* J: O3 O: {( X0 m& j) A

, u0 @$ i) m9 t( P9 S) |SURVEY AND SUMMARY Transcription by RNA polymerases I and III
( f2 ]+ B% ~! f" C8 Ihttp://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/28/6/1283/ s8 ?5 G2 t/ E0 X9 [0 K

6 L) o% z0 W+ x) k( ~( |! O( F. v; i, E4 ~+ ?
希望解决问题后能分享给坛子上的宝宝。

---

作者: hndxws    时间: 2010-7-25 20:53

因为大体上大家都知道怎么回事，就是具体的实验操作设计细节很难找到。我参考一下，看看能不能找到具体的东西，找到了的话就再发到这里。请用pBSU6做过这个的同仁也来讨论一下,给点提示。

---

作者: hndxws    时间: 2010-7-26 15:11

做shRNA的paper很多，但是用pBS/U6的不是很多，就我目前查到的具体操作还是这两种。具体操作是：
( B6 x, ^2 t2 E" R* z第一种，依次用ApaI、T4 polymerase（或Klenow酶），EcoRI（或其他酶）切割pBS/U6，ApaI是必须要选用的，最后一个酶可以随意选。合成的shRNA的5‘端应该设计成平端的，3’端是黏端的。
% f# Y. k% y2 c. K第二种，直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切，这样合成shRNA时，两端都应该设计成黏端的。# T* M+ m, }5 Z
这两个操作的paper我都有看到，而且第一种方法的paper稍多点。但是两个方案哪个更好，没有具体的证据。我这次做这个时，开始没有注意到这个细节，设计的时候，按照的是第二个方案做的，因为第二个方案简单。如果在不知道U6promoter是否是精确起始转录时，先想到的肯定是第二种方案。
) c4 y+ g/ B( x1 K' R. N) j; n* o等过一段时间，我做个转染，收个样看看是否第二种方案效率会受影响，就说明第一种方案是不是多此一举或者是必须要按第一种方案做。一切结论都是需要证据的。

---

作者: hndxws    时间: 2010-9-2 16:17

最近做了两次实验。用病毒介导shRNA转染细胞试了一下干扰效率，发现干扰效率还是很可以的，所以我觉得第二种方案对实验是没什么影响的，也就是说，可以直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切接入shRNA。
/ d! Y, \8 e! Z" W所以就我看来，有的地方说“U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G”。这个说法应该质疑一下。
+ P4 z- b9 K  |5 [. x. A* K至于第一种做法和第二种方案哪个好，我没对比过，至少第二个方案是没问题的。

---

作者: runsong    时间: 2011-8-15 11:24

你好，我想用pll3.7做shRNA，也是卡在如何确定U6启动子转录起点的问题上，不知到底需不需要在意这个问题，请赐教。

---

作者: hughliang    时间: 2011-8-16 01:16

回复 runsong 的帖子4 T+ q: g. {& k% h' M
7 ]- }  v$ \: K8 H! x( y1 e9 U9 A
我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达
5 E" M: O; F  q  _; x
0 M4 @- m  l: d; S" z同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。, I( o, N" }' l0 Z! Z
! R/ n7 X5 F% t! j  z3 s
官方Protocol也证实这一点：* v, A  R, e6 x/ M  h# C3 R
  N; g3 l; I  v5 J; d6 V, U9 c
http://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm
: w; g1 d6 H7 A" p* Z

---

作者: hughliang    时间: 2011-8-16 01:36


0 }) Z2 ]: p( A/ k1 ?& m1 [% p6 `: @: D& o* Z8 y
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
5 X$ c2 d) ?/ q7 N8 x& [& d' _. r) b) m, v- D( c
表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。) u& e: i$ B- _% V  E8 V+ K

( e" w6 q- N+ D0 B, x0 L! H7 z! H( p可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
( L' S* E* W- b5 Y1 m/ x7 y
: y8 a- Q6 f8 ?9 p3 I0 g向大家请教原因和克服的办法，先谢！/ t# W6 b0 I" d$ F. t% Q6 r. k% S

---

作者: fguw    时间: 2011-8-16 02:24

回复 hughliang 的帖子
1 [' J+ B5 v! Z0 `. L
7 Z2 E$ x( ^- X8 n5 s" w可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，4 n3 W, Q* @& g3 v3 @
没有实验结果验证，猜的
* L) p( f+ J% o8 x% X. ^作普通转基因有类似问题，3 M% W3 J  h2 l% i5 Q
有问题，欢迎探讨

---

作者: runsong    时间: 2011-8-16 12:23


& o& _6 D  h& R& R' j% _! @/ J6 |9 d- M8 x
回复 hughliang 的帖子
. T( j0 y) L# J2 e, j! |
* c+ h8 ?/ b; _0 s6 E0 Y十分感谢，你提供的线索太有价值了。
) v, m6 [% a  z即pll3.7中
% z1 |! J( i! a- eAn HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6.% T1 q3 A$ P8 `$ Q. |
引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC
5 C4 F. @' l7 [6 K8 ~而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。
; A" J: `$ Y# A《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）

附件: [Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定] 245.pdf (2011-8-16 12:23, 708.18 KB) / 下载次数 22
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MzE5Njl8OTczNDA5ZTR8MTc2MDkzNDM1MHww

附件: [Lentiviral RNAi Protocols - Cloning] pll37cloning.pdf (2011-8-16 12:25, 94.37 KB) / 下载次数 9
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MzE5NzB8MWE5YTQyZDJ8MTc2MDkzNDM1MHww

---

作者: hughliang    时间: 2011-8-16 13:53

fguw 发表于 2011-8-16 02:24   \- H, B: B; C. u6 Y
回复 hughliang 的帖子
# H/ B6 O% b; m; h7 Q2 f& @: K5 R9 [1 w1 K
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，

, G# y: Q2 L, L( x/ ?. Y% z是有这个可能。6 M6 h3 }3 N1 e) r! m7 w
8 V/ d8 @- R, o
但流式证实转染细胞仍有荧光，我在想是否细胞能补偿干扰的作用。

---

作者: hughliang    时间: 2011-8-16 14:10

runsong 发表于 2011-8-16 12:23
2 }! y% G) N/ m6 }4 M; ]% Q回复 hughliang 的帖子
/ X- W' K+ a( l. F; W% l" ~2 L: V8 M0 ^' T
十分感谢，你提供的线索太有价值了。

( k$ |5 j* M0 Y+ i
不客气+ S' N8 m' [3 E! M7 P; f

. X/ o& l; G3 W3 k$ s$ q5 Y1 d( W也分享两篇供参考& m, j$ o! N& }

. H: w+ R- G) R/ q祝实验顺利4 C( ]0 H) Z( y1 R
6 c$ F, e2 h9 X, @


附件: pLL3.7_stemloop_design.pdf (2011-8-16 14:06, 84.77 KB) / 下载次数 14
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MzE5ODZ8MWUwNzVkYzR8MTc2MDkzNDM1MHww

附件: pLL3.7-shRNA.pdf (2011-8-16 14:09, 590.77 KB) / 下载次数 15
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MzE5ODd8NGFjMDU2OWV8MTc2MDkzNDM1MHww

---

作者: fguw    时间: 2011-8-17 01:51

回复 hughliang 的帖子% [+ [5 a; B( O" f$ M4 P
3 p; Z1 x/ k# l
我觉得你做试验的细胞是多克隆？没有挑单克隆？# x, B. b) m3 k' t* {
流式证实转染细胞仍有荧光，大概阳性细胞比例多少？3 j* h0 n2 m! |2 p8 y
如果比例比较低，可能WB检测时更多的是非阳性细胞细胞（失活）信号。所以KD效果不好。& E' w/ M7 _" u5 b: J
还有，SHRNA 和GFP使用不同的PROMTOERS，可能在不同的LOCUS活性不一样，当然，我不太认同该观点。

---

作者: hughliang    时间: 2011-8-17 02:27

回复 fguw 的帖子
2 A1 P  A4 H, X
0 a+ \* t3 k! Z2 M* r& Q+ V是的，偷懒没挑单克隆。! U& D' ^, ]- A, I/ C* P

, W$ h$ Y5 L3 p我一般流式分选或G418筛选，但没挑单克隆。
8 x- r" C) y  j
/ p5 k: t6 X+ \6 N流式检测时带荧光细胞比例最低时约70%多，可能对干扰效应有影响。+ d8 y& b+ F, t( |+ R. R* l+ E

% ?  h, o- j1 R) T$ ]谢谢！

---

作者: sarah19860420    时间: 2011-12-6 00:32

回复 runsong 的帖子
3 P$ p1 k) ]$ t' c" x
3 X5 i+ h1 w  e2 J' C您好，我现在也是想用PLL3.7做shRNA。然后之前看帖子有的人说要形成这样的一个结构forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT
6 F) f/ b, L0 W+ I& greverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C
: i5 u1 `/ ^0 \; T2 a/ P) u  G" ?' k! G2 V. D2 Z
我想问的就是这个G点就是你们所说的U6转录起点的问题吧。那如果siRNA这个核心结构的开头就是以G开头的，还需要加G吗，你们的转录起点问题怎么解决的。我的载体是PLL3.7，酶切位点是Xho I，NOT I。能不能给我点建议。实验室没人弄过。所以想得到一个确定的答案。

---

作者: w20043459    时间: 2022-3-29 22:01

膜拜各位大神

---

欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)

Powered by Discuz! X1.5