干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 饲养层细胞的制备 [打印本页]

作者: 懵懂干细胞 时间: 2010-8-5 17:11 标题: 饲养层细胞的制备

今天杀了一只昆明白，取出了腹中7只小鼠，再去头、尾、四肢和内脏并取出每只小鼠的躯干表皮（鼠有点大，ribs长出来了）用于做饲养层细胞。
我觉得在去头和四肢的时候用镊子直接夹着用剪刀剪比较快，如去四肢的话用镊子夹着四肢把小鼠稍微拉起就可以剪了。取表皮的时候可以不去内脏，
直接剐皮比较方便，可以减少红细胞的产生。具体方法如下：
（1）取孕12～l4d的昆明白母小鼠，脱颈椎处死后，用75％乙醇浸泡消毒。
（2）无菌条件下取出串珠状子宫，置入盛有PBS的平皿内，充分洗涤，去除血迹。- K! O' R6 @. {+ `( C
（3）剥开子宫，逐个取出胎鼠，用PBS液洗涤，去除血污。
（4）去除胎鼠的头、尾、四肢和内脏，只留躯干，用PBS液洗涤，放入新的平皿中。
（5）用灭菌的眼科剪将躯干剪至1mm3（立方单位）大小，加入适量的0.25%胰酶，37℃ 下消化0.5小时。 C" |: O$ e8 {; m4 y- }- K
（6）加适量含血清的DMEM培养基终止消化，100目筛网过滤。" \3 I- M- y) A/ j4 ~
（7）将滤液吸至离心管中，2500r/min离心10min。
（8）弃上清（亦可再离心一次），用MEF培养液重悬细胞，调整细胞密度后放入T-75细胞培养瓶中。
（9）放入37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
（10）2-3天后，细胞基本长满时传代，记为第一代（P1）。 t- H- ]9 M7 v
（11）细胞长至P2-P3代时，用于制作饲养层细胞。

作者: yuhaoze 时间: 2012-2-24 10:54

学习

作者: songyang1987 时间: 2012-2-24 11:13

谢谢分享

作者: llecstem 时间: 2012-3-2 13:01

回复懵懂干细胞的帖子8 E3 W0 F& O# j8 b
/ z" z' k- C6 J9 j: }
想问一下，用P3代的细胞制作MEF的时候，1*的细胞复苏到一个10cm的盘子，几天可以长满？

作者: 懵懂干细胞 时间: 2012-3-2 15:40

回复 llecstem 的帖子

这样的问题不好回答，要看你的细胞活性和冻存时候的细胞数目怎么样啊？
复苏的操作等等都影响细胞复苏后生长的，复苏出来后你看一下细胞贴壁情况和细胞密度再自己% P* U3 b0 w8 w, |: A. P9 K# [5 |7 K
估算一下时间吧。

作者: zdgrp 时间: 2012-3-3 15:55

MEF用作饲养层细胞之前，还应该用丝裂霉素C处理，使细胞停止分裂吧？

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-5 10:47

回复 zdgrp 的帖子
! T u- D+ J- B0 N
肯定是需要用的

作者: mansnoopy 时间: 2012-3-5 10:47

回复 llecstem 的帖子
5 F( O; O: ]) k) X2 P9 ]& {
这个一般还是很快的 2-3天肯定可以

作者: igdb 时间: 2012-3-9 09:54

回复懵懂干细胞的帖子
( v( Z& ~4 x7 [( p8 \3 U7 y' L
第一代不是应记做P0嘛？？

作者: 懵懂干细胞 时间: 2012-3-11 17:06

回复 igdb 的帖子6 \1 P$ S$ l7 G% O# f

是的，大家都是记为P0代，谢谢提醒！！可能是我当时自己记为了P1代吧，不过也没关系的

作者: igdb 时间: 2012-3-12 09:25

回复懵懂干细胞的帖子
. P& M7 u! O+ a/ h$ j
嗯，叫法没关系。。大家别混淆就好

作者: 第一心音 时间: 2013-1-26 19:00

筛网是什么样的啊，谢谢

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)