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标题: 奇怪，神经干细胞消化后传代后细胞都消失了？（附图） [打印本页]

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-12 21:53 标题: 奇怪，神经干细胞消化后传代后细胞都消失了？（附图）

本帖最后由细胞海洋于 2010-8-12 22:30 编辑 ! @6 V* y7 v6 `7 n: F

[attach]12245[/attach][attach]12246[/attach][attach]12247[/attach]昨天给原代的神经干细胞传代（是第十天的原代细胞），传代前干细胞球还是挺好的。但是我用0.25%的胰酶消化成单细胞再过两天就什么细胞都没了，不知什么原因？请各位帮帮忙看看。我的胰酶是配好2月在-20℃冰箱里存放的。传代方法是：1。将培养瓶中的悬浮细胞及培养液吸入离心管1000转每分中离心5分钟。2。经上清液的一半加入新的培养瓶中（半量换液），其余的上清液吸掉，在沉淀中加入胰酶混匀，边用吸管吹打，约十分钟。3。再离心1000转每分 5分钟。4。吸掉上清液，加入新鲜培养基混匀后转入培养瓶中。因为怕用血清终止消化的话已引起神经干细胞分化，所以没用血清终止消化。不知道为什么到第二天一看，什么细胞都没有了，只有些细胞碎片。

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这是传代前的神经干细胞球，大家看看应该没什么问题吧？

作者: uyunbilig 时间: 2010-8-12 22:42

我觉得消化过度了，我在澳洲的实验室时候他们是BSA代替血清停掉干细胞的消化的。

作者: uyunbilig 时间: 2010-8-12 22:44

我觉得血清替代物应该也能停止胰酶消化，纯属个人的想法我没试过！

作者: rhmm 时间: 2010-8-12 22:52

我的也是，用同样的办法，有的时候可以，有的时候就不行，原代还好说，传代是个大问题，不过我觉得你的很可能是胰酶消化过了，我培养的时候根本不敢用胰酶，那个神经球太娇气了，我就是吸取悬液后直接吹打，离心，去上清，吹打然后又种植在培养板上，你那个有点复杂，为什么还要留一半上清呢，是考虑到神经细胞间的旁分泌了吗

作者: dulaiyouyu 时间: 2010-8-13 08:39

你的原代的神经球是没问题的，传代时，可能是酶消化过度，建议使用比较温和一点的酶，不要用胰酶啦。也有可能离心的时候出了点问题，会不会沉淀里只有碎片，活细胞被你弃掉了呢？

作者: exin11 时间: 2010-8-13 08:52

胰酶处理，消化过度，没有终止消化……都会导致细胞碎裂！( y/ n; U' y1 R
再者，离心转数可以再低点，900转4分钟。
不知道你的换液与培养环境怎么样？

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-13 11:15

回复 2# uyunbilig
谢谢，我试试您的方法看吧。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-13 11:18

回复 4# rhmm
我用吸管直接吹打时，干细胞球分散不开，所以就用胰酶消化了，您是用的吸管直接吹散的吗？因为看很多文献上都是半量换液，所以就采用了。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-13 11:20

回复 6# dulaiyouyu ) `* D, k+ s+ w: \
我离心完后在显微镜下看了，还有干细胞球的，所以应该不是离心的问题吧。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-13 11:22

本帖最后由 xfyang2007123 于 2010-8-13 11:23 编辑
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回复 7# exin11 # X. j. }+ Z, h6 j
谢谢建议，很多方面确实容易出问题，就只能挨点找原因了。另外我们这里的离心机是较老的那种，500转每分一个档，所以调不到900啊。

作者: jason 时间: 2010-8-13 12:40

你的培养的神经球还是不错的，说明培养基没有问题。但因为是原代10天的细胞，神经干细胞比例还很少，神经球还很松散，是很容易吹散的。) r+ e# N! x; g# ^9 ?$ J
如果传代两三代后，神经球就很紧实了，用普通的吹打很难将神经球吹散，所以要用酶消化。但千万不能用胰酶，胰酶消化会导致绝大部分细胞死亡，死亡的细胞释放的物质会导致其他活细胞都死掉的。换用sigma或invitrogen的accutase吧
还有就是前几代培养是不要半量换液，全量换吧。因为这段时间很多非神经干细胞逐渐死亡，释放很多炎性因子等会诱导神经干细胞死亡。

作者: sfk06 时间: 2010-8-13 15:57

或许可能与离心有关，所剩细胞太少不足以维持细胞生存环境。疑惑是某个环节的突然变化。你操作过程中有没有出现和以前不一样的事情？？？

作者: dulaiyouyu 时间: 2010-8-13 20:24

回复 10# xfyang2007123 ' o5 H& W* l+ y \. u3 f2 M3 P- N8 S

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试试用木瓜蛋白酶吧。比胰酶温和多了。然后用PBS漂洗就可以了。

作者: liyong7732 时间: 2010-8-13 21:07

培养NSC比较费钱，你要用B27培养，或者N2，消化时候有sigma的复合酶，好像是蛋白酶+木瓜蛋白酶+？？酶，忘了，你查找一下，这种酶消化温和！胰酶用的浓度太大，建议稀释到0.125或0.1% ，用血清中和后可以离心洗涤一次，不会影响太大，NSC本身在干细胞球中的含量就很低！祝成功

作者: liyong7732 时间: 2010-8-13 21:09

消化成小的神经球，不要消化成单细胞，长不起来

作者: mumudan 时间: 2010-8-14 00:18

换液时半量应该是怕神经球被吸掉，因为毕竟不是贴壁的细胞，但是传代没必要半量吸取吧，而且你传代消化十分钟貌似有点过了，控制在两到三分钟之内吧，用酶消化加上吹打时间还是不要太长为好，但是吹打最好用枪不要用吸管，而且用FBS如果离心后其实量是不多的应该不至于引起分化，应该不用担心，只是个人看法你可以改进看看。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-14 09:50

回复 12# jason " F1 I$ h& Y4 [6 |1 Z; K/ ?
谢谢指点。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-14 09:51

回复 13# sfk06
因为是原代培养首次传代，所以没有以前的经验，谢谢。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-14 09:53

回复 14# dulaiyouyu
哦，木瓜蛋白酶，不知道贵不贵，因为资金也有限，另外，请问您都是用这种酶消化的吗？效果怎么样？

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-14 09:56

回复 16# liyong7732
养这些东西确实比较费钱，太珍贵了，多谢祝福。我再摸摸条件吧。养了好几个月终于有点头绪了，但还很不成熟。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-14 09:59

回复 17# mumudan
谢谢仁兄指点，要是能成功就太好了。

作者: dulaiyouyu 时间: 2010-8-15 14:08

回复 20# xfyang2007123 ' s3 `4 q- X* p3 K# I
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恩，价格确实比TE要贵，有不少实验室用这个酶的。

作者: 懵懂干细胞 时间: 2010-8-15 14:41

楼主你好，你用胰酶消化了10分钟还边吹打，你没终止消化就拿去离心，在离心的过程中也在消化啊，也就是相当于消化了15分钟，细胞受不了消化这么久吧？神经干细胞我不培养过，我一般消化就是2-5min。居然是悬浮细胞的话会不会不用胰酶消化也可以呢，直接离心加了培养液过后吹打分散分装好像就行的吧，像悬浮培养昆虫细胞SF9不用胰酶消化的。建议离心时间可以短一些，2-3min就可以，加陪液后可以再离心一遍再重新悬浮细胞（可以达到清洗遗留胰酶和减少细胞伤害的目的）。

作者: SVZ 时间: 2010-8-15 21:02

本帖最后由 SVZ 于 2010-8-15 21:04 编辑 ; T$ s5 E! l1 D
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我做神经干细胞离心用的是1000rpm，3min，我把上清吸出拿到显微镜下看过，基本没什么细胞了。另外我使用的消化+机械吹打的方法。用invitrogen公司新上市的TrypLE消化液（说是胰酶替代液，作用较为温和些），消化5-10min，先在胰酶中将神经球基本吹打开后，再加入3倍TrypLE量的DMEM/12稀释，进一步吹打，约15-20次，不用加终止消化液（TrypLE说明书上说可以不加），离心，1000rpm，3min，培养液重悬细胞即可。' u1 t$ B% G" G
我养的细胞没有出现过你说的情况，但基本上是传到第3代就开始有一些神经球容易贴壁分化了。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-19 10:07

回复 24# 懵懂干细胞
多谢指教。我仍旧要再取原代细胞，从头再来！

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-19 10:09

回复 25# SVZ 8 ~( P4 x3 g& L) i* C
哦，太好了，请问您培养的也是大鼠胎鼠神经干细胞吗？以后常交流。

作者: 懵懂干细胞 时间: 2010-8-19 12:30

祝你好运。

作者: guojingjing 时间: 2010-8-28 21:00

0.25%的胰酶对干细胞的损伤可能比较大，尤其是消化时间长达10min，一般的细胞消化液不需要那么长时间。可以尝试机械分散或者降低胰酶浓度

作者: xfyang2007123 时间: 2010-8-29 13:17

回复 29# guojingjing
谢谢帮助，因为是神经干细胞球，所以感觉很难消化。请问你们的机械分散法是用的普通吸管吹打吗？一般吹打多少次可以？谢谢。

作者: guojingjing 时间: 2010-8-29 16:00

回复 30# xfyang2007123

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在1.5ml 离心管里加入200微升培养基，大概要吹打两三百下，不过建议可以用0.05%的胰酶短暂消化一下，再吹打就会容易一些

作者: lhmxm 时间: 2010-9-4 14:49

"边用吸管吹打，约十分钟"时间太长了，对细胞损害太大

作者: xfyang2007123 时间: 2010-9-4 21:33

回复 33# lhmxm & }, O6 L4 s1 e, j4 T
估计是那样吧，呵呵，改进中！

作者: jennyshy 时间: 2010-9-20 21:31

我遇到过，问题就是消化过头了。! U2 M6 l% K, F( r ]
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原代细胞没有问题。传代的确要小心，胰酶也很难掌握消化的时间和使用浓度，个人认为如果在你加胰酶吹打时出现絮状的东西时就说明消化有点过了。我现在用siama的accutase，效果很好，一次也就用60微升左右。你不妨试试

作者: xfyang2007123 时间: 2010-9-21 09:09

回复 35# jennyshy

Thank you!

作者: qiuweiqin0618 时间: 2010-9-21 10:48

回复 25# SVZ , x. W; P% j* h0 k" [

赞同你的观点

作者: tieyun 时间: 2010-10-4 21:32

是鼠的神经干吗？建议改用0.05%胰酶加吹打消化，时间不要超过2分钟。可以用10%血清终止，再用培养液洗一次细胞团就好。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-10-5 09:58

回复 38# tieyun
我用0.125%的胰酶消化加吹打也吹打不开呢，仍在一团。所以换了accutase试试。

作者: dingyx2009 时间: 2010-11-4 23:17

最关键的一点绝对不能在胰酶中吹打细胞的。只有细胞碎片就是这个原因。
我一般把含细胞的培养基取出，离心1000转5分钟，完全弃上清，加入胰酶加EDTA消化，孵箱孵育30分钟，每隔10分钟左右可取出震荡摇匀。10％的胎牛血清终止消化，1000r/5min,弃上清，培养基漂洗2次，再加入干细胞的培养基吹打15次左右，基本都是单细胞，分瓶培养。
一直效果很好的。至于那一点残留的血清，根本达不到干细胞分化的程度。

作者: dingyx2009 时间: 2010-11-4 23:21

回复 9# xfyang2007123 4 k/ ?& F8 P b1 K+ D& o* Q' Q1 _
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如果是想半量换液，将含细胞的培养基离心后，上清全部取出后，在种细胞加入一半新鲜培养基一半旧的即可。

作者: xfyang2007123 时间: 2010-11-6 09:18

回复 40# dingyx2009
谢谢关注！那么请问你们用的胰酶/EDTA浓度是多少?我试过0.1%的胰酶基本可以达到目的。但是还是感觉对细胞破坏挺大的。

作者: crystal20101026 时间: 2010-11-7 22:11

离心的速度可以降低点，我用的是800转/分，3min，就可以了。而且我觉得还是应该终止消化。神经球的密度还是比较大的，一般这种速度就可以了。这样养出来的细胞比较好看。

作者: ouyangjuan 时间: 2010-11-8 20:10

我是直接离心，再用0.05%的胰酶37°消化十分钟，再轻柔的吹打数十下，再用sigma的trpsin inhibitor终止消化，最后离心去掉胰酶，传代培养就一直能养下来！

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