作者：龚辉，张义成，刘文励作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科，武汉 430032 ' i& }* o, v$ h- S+ L& i! G : R( W/ ]; u6 {5 V9 E1 X; c) M 2 N& }$ K0 x3 B0 w+ y7 c 2 i5 [5 i8 h* J( Y+ A# [ ( ]0 g, P( t+ L7 Z , K$ p1 f0 v" e% q7 x* I' N+ f! }6 _ % W: W! t O7 a: M; m! Y; R A; ]4 P: Z9 C: @5 I( E & u Z J; {& _) F" y1 T" f ! Y& D2 E3 A4 O3 O - }3 A3 N. a8 ~4 v- N E) u
/ Q3 C0 g) N' a b5 ~ o
【摘要】 造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）的自我更新维持每天血细胞数量，Bmi-1基因属Polycomb(PcG) 基因家族成员。最近研究表明，Bmi-1在调控正常和白血病干细胞的自我更新中起重要作用，本文就Bmi-1的结构，功能和在造血干细胞的自我更新中的作用作一简要综述。 7 [: B3 _" P4 Z; ]6 F: k3 W, |% b# H 【关键词】造血干细胞 8 f/ r3 t ? Z9 O( A; b RegulatoryEffects of Bmi-1 Gene on Self-renewal of Hematopietic Stem Cells—— Review! W0 P) U/ ?. q8 L! L9 e2 C! E
4 {' B$ n; p4 t1 o. C GONG Hui，ZHANG Yi-Cheng，LIU Wen-Li * E! I: i7 } l! q" v" P4 P. l( h) U
Department of Hematology，Tongji Hospital，Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China2 ?& F; b8 v/ c0 B
) t( T9 q6 Z. w# K! b# p# {
Abstract Self-renewal of hematopoietic stem cells is vital for the sustained daily production of blood cells.The Bmi-1 gene is a putative oncogene belonging to the Polycomb group family.Recent studies have shown that the Polycomb-group gene Bmi-1 is indispensable for regulation of self-renewal of normal and leukemic stem cells.Theresearchprogresson structure and functionof Bmi-1 gene，and its role in self-renewal of hematopoietic stem cells was reviewed. $ J4 k7 j- O- A% W % a" r2 O' W9 h3 {/ B; N Key wordsHematopietic Stem Cell; Self-renewal; Bmi-1 gene8 c3 S K% X' [# g$ ?
4 U# S# _7 h. c& [0 z" e3 V& J8 U( ] mBmi-1基因是荷兰癌症中心1991年在癌细胞中发现的，它具有阻抑子(repressor) 的功能，可以阻断细胞周期中的两种关键抑制蛋白［1］，因此认为它是一个癌基因。近年来发现，它在正常和白血病干细胞（HSC）的自我更新中起重要作用［2，3］，本文就Bmi-1的结构，功能和在造血干细胞的自我更新中的作用作一简要综述。 % F j% U; Y4 p' y J) T( I$ I6 h# n9 o$ J
Bmi-1基因的结构 5 z5 a. v* Y3 a6 L+ }$ A; i ! p/ d/ `6 r& F v, H7 ^2 q. P Bmi-1基因(B cell-specific MLV integration site-1)的表达产物为鼠类淋巴瘤滤过性病毒（bmi-1）致癌基因同源体。该基因克隆和定位在染色体10p13，其共有959个腺嘌呤、591个胞嘧啶、678个鸟嘌呤和975个胸腺嘧啶。该基因突变能与Myc致癌基因一起产生作用，引起B细胞性非霍奇金淋巴瘤。Bmi-1基因属Polycomb(PcG) 基因家族成员，Polycomb是一个在机体发育过程中控制基因活性的基因家族，Polycomb家族基因在非性染色体基因的沉寂中发挥作用，而非性染色体基因的静默机制目前仍然在探解中。Polycomb家族包括RAE28，Bmi-1和EZH2等，调节染色质的改造，充当转录抑制物并与正常干细胞功能和癌干细胞有关［4，5］。Bmi-1蛋白作为转录抑制因子能保持靶基因特异的稳定抑制状态，为发育所必需。研究发现93%鼠和90%人的cDNA同源开放阅读框编码324个氨基酸的蛋白质，根据氨基酸序列推测95%和94%的鼠和人同源。预测鼠BMI-1蛋白藏有一个新的锌指结构和一个螺旋-转角-螺旋结构，同时证明Bmi-1除脑以外的正常组织均有表达［6］。 T! t C; R* ~$ X6 I% w8 G3 G0 Q
/ E& z' A3 L- A' b# T
Bmi-1的作用和功能7 ~) Z/ i" _% T& @
/ p. E% I6 e5 X0 z Bmi-1维持正常及白血病干细胞的自我更新4 y- {: L0 g+ h2 q6 n. T+ r
+ b0 \* X' B6 t# z0 S
Bmi-1敲除（knockout） (Bmi-1-/-) 小鼠在胚胎期 (胎肝) HSC 数量正常，但小鼠出生后，骨髓HSC数量迅速下降，体外培养二次集落形成明显减少，移植Bmi-1-/-小鼠骨髓给同基因受体小鼠只能短暂支持造血，没有观测到成年期HSC的自我更新，标志着Bmi-1-/-小鼠造血干细胞存在自身缺陷。研究结果显示，缺乏Bmi-1 的造血干细胞不能持续到成年期［2］。增加Bmi-1的表达能促进HSC自我更新，Bmi-1表达能增强HSC的对称分裂并通过干细胞分裂调高遗传概率。重新转染Bmi-1能导致体内祖细胞多种潜能的扩增并使HSC在体内再植入能力显著增加; 因此Bmi-1是HSC自我更新的一个中心角色［7，8］。通过体外转化Bmi-1-/-小鼠HSC或造血祖细胞形成的急性髓细胞性白血病(AML)祖细胞体外培养时生长停滞迅速发生，分化、凋亡和体内致白血病能力消失［3］。 因此，Bmi-1基因对小鼠白血病形成不是必需的，但对维持白血病干/祖细胞的自我更新和体内致白血病能力有决定性作用。) U1 Z% ` q* q! |* }9 o
: a$ M I+ u! D9 f' B
Bmi-1基因与抑癌基因INK4a/ARF2 q. [8 [$ O' G" F+ E; j/ L
. @ B4 Q# q, a; b7 [4 n
INK4a/ARF基因位于人染色体9p21，是人类肿瘤常见的基因失活位点。该基因通过基因重叠编码两种抑癌蛋白：外显子1α、2、3编码p16INK4a，外显子1β、2、3编码p14ARF（人）/p19ARF（鼠），二者具有独立的转录调控区。Bmi-1蛋白作为转录抑制因子能够保持特异靶基因稳定的抑制状态，为发育所必需。在鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）和人成纤维细胞WI-38中得到了一致的实验结论： Bmi-1抑制INK4a/ARF基因位点，对p16INK4a转录具有显著负调控活性［2］。Bmi-1作用于染色体水平，影响INK4a两个转录产物的表达。 ) B1 W& r9 U3 V % V$ i) \6 A; @) YSpike等［9］认为，pRb对p16INK4a有负反馈抑制作用。在大多数人类癌中RB肿瘤抑制通路功能失活。恶性血液病RB 失表达在急性髓性和淋巴细胞白血病中有广泛报道，套细胞淋巴瘤中周期蛋白D1功能放大，并且抑癌基因p16/INK4a 在AML和各型淋巴瘤频繁发生沉默，p16/INK4A表达沉默是由于它的启动子CpG岛过度甲基化导致，但也可能同时通过激活Bmi-1，如在淋巴瘤E2A-Pbx1联合转位。 2 O5 v+ m0 }9 K 7 ?* d- K# o2 i. ?' }5 ap19ARF（人类同源物为p14ARF）是INK4a/ARF基因编码的另一种抑癌蛋白，可通过p19ARF/p53途径发挥作用。含有T-box保守序列的T-box基因TBX2可抑制p19ARF启动子并削弱E2F1、Myc或Ras对p19ARF的诱导作用，从而下调p19ARF。TBX2表达增加见于乳腺癌细胞，它可促进乳腺癌发展。另一T-box基因TBX3负调控ARF表达并抑制衰老，点突变可使其失去此抑制作用。TBX3点突变见于一种增殖低下的遗传病——Ulnar-Mammary综合征，p14ARF表达失控或许参与了这一综合征发病。 7 }: z7 M0 u) K* v$ w% N1 L, L. q' D( O: [# k9 u4 l2 T& X1 h
基因表达分析显示，干细胞表达相关基因、细胞生存基因、转录因子和调控增殖基因p16INK4a and p19ARF在 Bmi-1-/-小鼠骨髓细胞中发生改变。在正常骨髓中p16INK4a和p19ARF的表达导致增殖阻滞，细胞呈依赖p53的凋亡 ［2］。6 Z4 A. k0 O# r5 E! a2 W
" w+ G: D/ ?+ A/ y `7 ^8 R
Bmi-1基因敲除的小鼠有骨骼、造血和神经学功能的缺陷，出生后的生长也出现延迟。尽管Bmi-1基因缺陷小鼠能存活至成年期，但它们最终死于造血和神经系统缺陷［9］。Bmi-1促进小鼠淋巴细胞的增殖并且直接或间接地抑制部分胚胎成纤维细胞，Cdkn2a编码两个细胞周期依赖激酶抑制物p16INK4a和p14ARF的表达［11，12］。然而，敲除Bmi-1的小鼠INK4a和ARF仅部分地挽救淋巴细胞数量，因此它们应是增殖中受Bmi-1调控的下游通路。: }! D" A3 i" \' T$ Y; n
+ f; J8 N, j2 ^9 [+ J+ y# Z. U
Bmi-1基因与造血干/祖细胞的细胞周期的调控 5 i( ~5 w. p- J6 L! k- j0 w" q* A
为了既维持成熟血细胞的补给又不使干细胞在机体预期生命期限耗尽，多数HSC保持静止，仅仅少数细胞进入细胞周期。外界因子如细胞因子对HSC细胞周期的调控至关重要，并且与骨髓中基质细胞和细胞外环境交互作用。另外，HSC内源性转录因子的表达，包括 c-Myc、 GATA-2、 HOX家族蛋白和Bmi-1，也通过影响基因转录控制它们的生长。按照细胞周期调控的特殊规律，p21WAF1(p21)和p27KIP1 (p27)显示维持 HSC和祖细胞静止，从而调节可利用的细胞池比例［13］。/ a8 W( T) c% {6 Q7 }
% Q9 ]5 X+ p2 ^# M: j
p16INK4a是细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）抑制因子，阻碍pRb蛋白磷酸化，将细胞周期阻断在G1期。而ARF可结合原癌蛋白MDM2，稳定p53，将细胞周期阻断在G1期、G2/M转换期或诱导细胞凋亡。在各种类型恶性血液病中经灭活和（或）删除观测，p16INK4A (p16)和 p15INK4B (p15)担当肿瘤抑制因子的作用。Bmi-1抑制INK4a/ARF基因位点，对p16INK4a转录具有显性负调控活性。这些结果证实适当的细胞周期控制，特别在干/祖细胞早期阶段，是保持正常造血所必需的。3 R9 }" J7 Z: Y' w; \
7 T. `% @* I8 o* A1 p
STAT5A 与Bmi-1基因" ^4 K z7 f! S2 f2 F
I3 r$ T2 b; P3 V# R 信号转导和转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）家族作为潜在的细胞转录因子介导多种生物学反应［14］。 利用鼠胚胎-OP9基质共培养体系诱导胚胎干细胞(ES) 向HSC分化的模型研究发现，STAT5A的过表达促进在OP9共培养体系中5天内表达内皮-成血管瘤标记Flk-1的ES细胞产生子代细胞。首先CD41 / CD45 /c-Kit /(Flk-1)-造血细胞在5-7天间产生培养条件。通过甲基纤维素进行克隆分析，与对照组相比STAT5A 持久稳定的激活极大地增强造血祖细胞的产生。STAT5A 可以上调几个造血相关的基因如Runx1/AML1、 血管内皮生长因子、肿瘤抑制因子(oncostatin M)受体、HoxB4、 Wnt5A、 Delta-like-1和Bmi-1的表达，因此增强STAT5A的活化、上调Bmi-1等造血因子的表达可促进胚胎来源的造血干细胞在体内的造血功能［15］。( t# ~2 P2 s8 t
! j! t$ t' P$ f2 A' J% z, G
结语. J! Z6 D% `' e) @0 C* a
# I. ^( Q5 H5 {# c3 ?
有活性的Bmi-1是造血干细胞自我更新所必需的。它通过抑制INK4a/ARF基因位点、对p16INK4a转录进行显性负调控、并受信号转导和转录激活蛋白STAT5A上调等机制使干细胞自我更新。 但有些问题，如WNT信号转导通路和Bmi-1调控干细胞自我更新作用的关系是BMI-1表达或功能刺激响应WNT信号转导？还是这些通路分别独立地控制干细胞自我更新？细胞突变能否再激活Bmi-1基因的干细胞自我更新通路？有待研究查明。由于白血病干细胞处于G0期，它们可逃避化疗而造成白血病的复发; 鉴于Bmi-1在白血病干细胞的自我更新中的关键作用，针对Bmi-1的靶向分子治疗有可能成为清除白血病的微小残留病变并控制白血病的复发的有力的手段。 ' s8 l4 ]: @# {% h, ]" L9 s- b- E- P0 K& l- b" v q2 u
: F, z" A( @& Q! e+ q 【参考文献】' z: q- |/ d& B$ i
1van-Lohuizen M，Frasch M，Wientjens E，et al.Sequence similarity between the mammalian bmi-1 proto-oncogene and the Drosophila regulatory genes Psc and Su(z)2.Nature，1991; 353(6342):353-3552 b; i* s/ i1 \" N7 K& K
* |) m0 D+ S; z% f6 }4 g( V9 w. r2 ?8 m+ D8 o+ U5 F4 B/ D; X5 h1 \
4 F$ D$ ?# L. V1 c3 e. N& a) C
2Park IK，Qian D，Kiel M，et al.Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells.Nature，2003; 423（6937）:302-305% z1 V4 A9 C D7 R
- E! F1 a: N8 J
2 W. z2 K8 B0 \% J
0 u% V4 V3 A" J9 S" W
3Lessard J，Sauvageau G.Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells.Nature，2003; 423 (6937): 255-260 4 J2 ~2 l0 W6 G+ V: B- E/ j+ v0 e8 {: u U: W( m% z1 }
' x; T. D( B f) p1 e 5 C: R* P2 J0 S) i6 }# d 4Osaka M，Koami K，Sugiyama T.Cloning of the rat proto-oncogene bmi-1.Cancer Lett，1998;133:57-622 d; r4 D9 q+ {7 g/ K: N5 Y
" F% M2 V6 d, U1 j; J
: n* ], D# t" S* e+ U
4 T. P! q ?, y& d 5van-Lohuizen M，Verbeek S，Scheijen B，et al. Identification of cooperating oncogenes in E mu-myc transgenic mice by provirus tagging.Cell，1991; 65:737-752 8 o Y4 t; `" x2 }! ~# o' K7 M" G4 z ' a( N; f) @% T: ]0 U. D0 ^( \" c P1 c' ]9 [
8 {* d' U& R1 A+ u1 I, Z" ]+ B/ d
6van-Kemenade FJ，Raaphorst FM，Blokzijl T，et al.Coexpression of BMI-1 and EZH2 polycomb-group proteins is associated with cycling cells and degree of malignancy in B-cell non-Hodgkin lymphoma.Blood，2001; 97:3896-3901 } J0 J0 U5 k9 c
/ i( |2 K2 ?! N: ?. Y . b G$ e3 Y# h$ x- i! ~' {! F( e8 g% i) O' ] i; E( |: y$ i) h; k
7Raaphorst FM.Self-renewal of hematopoietic and leukemic stem cells: a central role for the Polycomb-group gene Bmi-1.Trends Immunol，2003; 24:522-524. J6 D8 E$ p( b+ k% \9 y" x& Y