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标题: 第三代测序（附上几篇重要文献） [打印本页]

作者: exin11 时间: 2010-8-24 08:57 标题: 第三代测序（附上几篇重要文献）

第三代的测序技术是由Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序）。2 j7 c; }9 r8 e  W* ^
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要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。! l* ^% Z* x8 \, g2 H
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

第二个是纳米微孔。因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止（见图）。) Y' r, Z2 x  i6 N" Z; O
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第三个是共聚焦显微镜实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。由于我对显微原理的物理知识匮乏，而Pacific Biosciences公司又没有非常强调在这方面的发明，不做进一步探讨。! t$ @$ j" T2 B+ Y3 \/ X
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他们还对这一技术进行进一步的优化。! z: m# a5 K$ f0 }, t5 v

第一个是把双链DNA环化反复测序。人们可以在双链DNA的两头连上发夹结构的DNA adaptor，从而使DNA环化。而DNA聚合酶就能够以环化的DNA作为模板滚环复制，反复测一段DNA序列。这种反复测序，纠正了偶尔出现的复制错误，从而使测序精度非常高。0 d7 O" X3 B$ _( {2 @2 A  _- }3 U5 E) [

第二个是激发光中断测序法。DNA聚合酶虽然很稳定，但是在强大的激发光作用下酶也是有一定寿命的。如果把激发光中断一段时间，在这段时间内DNA聚合酶继续复制DNA，当激发光重新开启以后，人们就可以测到长DNA链后面的序列。8 O) x% r; p8 b5 I, [2 u, j  r
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第三代测序技术非常可怕。1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。3、它的精度非常高，达到99.9999%。

此外，它还有两个应用是二代测序所不具备的。

第一个是直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。

第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。

Pacific Biosciences公司预计2010年或者2011年就会推出商业化的测序仪器。在不远的将来，如果他们能和二代测序一样集成100万个纳米微孔，那么一台仪器15分钟就能够准确地测出一个人的基因组。以后每个人的基因组测序成本将变成100美元，人人都可以消费得起。想想人类基因组计划耗资30亿美元，费时十几年，无数科学家参与其中，技术的革新意义是多么重大啊！9 f3 j$ a# f* ?
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作者: lixiaodong 时间: 2010-8-24 09:44

一定要顶。科学技术就是生产力。Gilbert和Sanger法测序才不到四十年，就有这么大的发展。Impossible is nothing。

作者: flydayzhu 时间: 2010-8-24 11:59

极好的消息啊~

作者: 张也行 时间: 2010-8-24 12:03

长见识了！呵呵

作者: susannajoke 时间: 2010-8-24 12:31

这个太牛了！

作者: susannajoke 时间: 2010-8-24 12:36

第三篇下不下来好像

作者: 军医 时间: 2010-8-25 22:45

xiexiefenxiang

作者: weiyepan 时间: 2010-9-17 17:07

太强大了

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