作者：程伟 刘时觉 郑国庆 王小同作者单位：温州医学院附属第二医院脑科中心,浙江 温州 325027 ; [; _1 \! L P( X: ` 6 O/ K8 x1 V: F+ I( v3 H ; P4 W4 [/ O) l2 J6 T) a) n' b
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脑梗死（cerebral infarction）是严重危害人类健康的疾病之一，在我国的发病率约在53.39/10万～182.60/10万之间，每年新发病人数约100万，患病人数也在400万人以上，幸存者中约3/4不同程度丧失劳动能力〔1〕，给家庭和社会带来沉重的负担。但迄今为止，脑卒中造成的神经细胞损伤和死亡尚无确定有效的治疗方法。一旦脑卒中的缺血损伤发展到最大程度，即可导致不可逆的神经功能损伤，难以恢复到发病前的状态。即使是能得到及时治疗，许多患者仍然留有永久性神经功能缺失症状，遗留不同程度的残疾。目前，国内外研究人员从溶栓治疗到介入微创治疗，力求恢复血供，保护处于“缺血半暗带”的脑组织。然而，脑梗死的治疗从应用多种药物和（或）中医中药及康复治疗等，但都不能阻断脑损伤的发生或促使受损脑组织再生。因此，受损脑组织的修复与神经功能的恢复始终是人们追求的理想的治疗境界。近年来，研究人员对通过细胞移植恢复脑功能给予了极大的关注，已有的实验研究表明，细胞移植不是对抗神经病变的病理过程，而是通过其潜在的自我修复功能使受损组织得以新生。有鉴于此，随着近年来干细胞生物学领域的飞速进展，以干细胞移植治疗脑梗死的方法应运而生。干细胞是指具有增殖和分化潜能的未分化的原始细胞，有高度的自我更新和多向分化潜能，以干细胞为基础的细胞移植替代治疗在脑梗死的动物实验研究中显示出了良好的效果，有望给脑梗死的治疗带来突破性进展。本文就干细胞移植治疗脑梗死的研究进展和存在问题试作论述。, s1 ^& X1 {" b: C5 [
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1干细胞向神经元样细胞分化的体外研究 2 X0 c J# A8 i3 f 0 v& e; _/ H: F7 [# A1 F$ L" `' L5 Y; i. ~
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依分化潜能的大小,干细胞大致可分为3种类型:①全能干细胞(totipotent stem cells，TSCs),这种干细胞具有形成完整个体的分化潜能，胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)就属于此类；②多能干细胞，具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去发育成完整个体的能力，如间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)；③专能干细胞，只能向一种类型或者密切相关的两种类型的细胞分化。位于成体组织的干细胞通常是后两种干细胞。MSCs最早发现于骨髓中，亦称做骨髓间充质干细胞，此外，在脐血、外周血和胎肝中均存在，这是一类具有高度自我更新和分化能力的多能干细胞。脐血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿侧血管内血液,脐血内干细胞含量丰富,占有核细胞的0.98%〔2〕，是造血、间充质、神经等多种干细胞的丰富来源。在神经系统疾病治疗中，骨髓来源的MSCs以及脐血来源干细胞目前研究较多，有着良好的应用前景。近来许多研究表明,在一定的诱导条件下，骨髓和脐血来源的MSCs在体外培养或体内移植后可分化为神经元样细胞,并可促进动物神经功能受损恢复。研究者们尝试了各种手段以期找到效率较高的诱导方法，包括几种化学诱导剂联合，生长因子之间配伍，化学诱导剂与生长因子联合，单味中药，中药有效成分，或应用接近生理状态条件的培养基等。对于骨髓或者脐带血来源干细胞体外定向分化为神经细胞的研究（见表1），运用不同的诱导剂组合，还是选取合适的单一表型细胞群作为细胞来源，亦或是二者结合是否能更有效提高诱导分化效率，仍需要深入研究。& }. Q9 H$ `7 a' a- U5 E
1 F }: j5 T* B+ T0 ]/ i 2干细胞移植在脑梗死治疗中的应用2 M T& |, o% P9 s$ J3 C; p. Q. P
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中枢神经系统损伤后的自身修复能力是比较有限的，因此细胞移植替代治疗成为近年来神经科学领域研究的热点之一。1999年，Kopen等〔12〕首次在世界上将小鼠来源的MSCs注射入新生小鼠侧脑室，移植后12 d，部分植入的MSCs迁移至前脑和小脑而没有破坏宿主神经细胞组织结构，另外一部分MSCs融合至纹状体和海马，表达胶质细胞标记GFAP,分化为星形胶质细胞。2001年，Chen等〔13〕研究发现，大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）大鼠尾静脉注入经维生素A衍生物处理过的人脐血细胞后，动物的行为能力有所改善，神经功能缺损评分（neurological severity scores，NSS）高于模型组，14 d时脑内可见鼠抗人单克隆抗体1281标记的阳性细胞，部分移植细胞在损伤侧大脑表达神经元特异性标志物MAP2，神经元核抗原（NeuN）及星形胶质细胞标志物GFAP。2005年，王颖等〔14〕采用分离消化Fischer344大鼠的骨髓MSCs进行体外培养、纯化鉴定后,进行诱导分化,局部立体定位注射于MCAO大鼠纹状皮质18区,对照组注射无血清低糖达氏修正依氏培养基（low glucose Dulbecco′s modified Eagle′s medium，LDMEM），发现移植后第2周及第8周对照组、实验组于水迷宫试验中找到目标的时间(s)及路径(cm)均有显著差异(P＜0.05),第8周时实验组与对照组相比，网屏握持、抓握牵引及平衡木行走等试验的时间亦存在显著差异(P＜0.05) ，实验结果提示诱导细胞的移植对MCAO模型大鼠的运动功能有明显恢复作用，病理学检查在诱导细胞实验组可见梗死灶侧皮质部位神经细胞增生,细胞密度显著高于对照组大鼠。2006年，Ryo等〔15〕在大鼠MACO模型建立6 h后，静脉注射骨髓MSCs和外周血来源的类MSCs（MSClike Multipotent precursor cells,PMSCs）,随后在6 h，1、3、7 d分别用MRI检测梗死灶体积，灌注加权成像（Perfusionweighted image,PWI）观察颅内血液灌注动力学变化，踏车负荷实验检测大鼠神经功能改善情况，结果提示MSCs和PMSCs治疗组大鼠脑梗死体积明显小于对照组，颅内局部血液灌注好于对照组，神经功能恢复显著优于对照组。因此，干细胞移植可能是脑梗死治疗的一种很有前景的途径，值得进一步探索。 Q+ z2 J+ n: e- p
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表1干细胞体外定向分化为神经细胞的各种诱导方法及神经分化特异性检测（略）7 g+ I! C% q2 C- E3 ^! h
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3MSCs移植治疗脑缺血的机制探讨+ t: o4 g' ]- J: [' L0 M
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. A/ F/ }& j |. S- a MSCs移植治疗脑梗死的机制相当复杂，目前尚不能完全阐明。2001年，Li等〔16〕用人骨髓间充质干细胞（hMSCs）移植治疗脑梗死大鼠，发现1％～5％的植入hMSC呈现脑实质细胞蛋白表型，治疗组局部BDNF和NGF显著增高，缺血半暗带细胞凋亡显著减少，梗死侧室下区增殖细胞明显增多。2006年，Horita等〔17〕、Liu等〔18〕均发现MSCs移植后局部一系列神经营养因子如BDNF、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、NGF、EGF和bFGF表达增高，这些因子可能通过清除自由基，抗炎，减低兴奋性氨基酸的毒性作用等多种途径发挥神经保护作用减少凋亡的发生。2001年Akiyama等〔19〕、2003年Inoue等〔20〕研究认为，MSCs具有神经修复作用，MSCs植入后可能参与了髓鞘的再生。2006年，Liu等〔18〕研究发现MSCs植入局部血管内皮生长因子（VEGF）、bFGF表达增高，它们可能减轻内皮细胞的缺血损伤或者促进局部血管新生。同年Ryo等〔15〕研究发现MSCs治疗组PWI检测局部脑血流量明显高于对照组，据此认为MSCs改善MACO大鼠神经功能的机制之一是增强局部脑血流量，组织学检查发现局部微血管增生明显比对照组多。综上所述，干细胞移植治疗脑梗死的机制可能有：①通过促进局部多种神经营养因子的产生，这些因子可能通过清除自由基，抗炎，减低兴奋性氨基酸的毒性作用等多种途径发挥神经保护作用减少细胞凋亡的发生。②通过促进VEGF、bFGF等的产生而刺激血管新生，增加局部脑血流量而对抗缺血的损伤。③植入的干细胞分化为神经元样细胞或者少突胶质细胞而替代已坏死的细胞。然而，其机制可能远比我们了解的复杂，尚需要更广泛和深入的研究来阐明。! N7 _) T+ e7 l1 ?$ q% Q3 a
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4干细胞移植在脑梗死治疗中存在的问题 8 x8 i/ q, i2 i. g* t; U 9 g% N2 E, v% h1 R( ?9 Y: H . a. I* d3 V- `* B8 ` " W7 H* d4 u: R+ I- Z9 H 脑梗死后，梗死区由于血流供应低于脑组织最低需求而发生坏死，而缺血半暗带的细胞则是可能被拯救的，因此，在合适时机选择合适的干细胞移植入缺血半暗带以取代坏死或凋亡的神经元，发挥其作用，是研究者们期待的结果。在干细胞移植的各个环节，如早期增殖、定向分化、植入体内并迁移、能否克服宿主免疫排斥而存活并发挥相应功能，都直接影响到移植的临床疗效。( |+ ]2 h: I' Z v
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脑梗死后干细胞移植治疗的适宜时机，目前仍不明确，动物研究从脑梗死模型建立后1～35 d移植均有报道〔21〕,不同时机移植后植入干细胞的增生、迁移、分化，对局部细胞因子、宿主神经细胞凋亡以及神经功能恢复影响的研究还较少。理论上讲，在脑梗死的急性期，半暗带的侧支循环较差，灌注不足，兴奋性氨基酸的毒性作用，Ca2＋稳态的失调，自由基的连锁反应，炎症反应对植入细胞的存活均不利。而脑梗死的恢复期，疤痕组织的形成也有可能会影响移植物的生长。植入外源性的干细胞的合适时机尚待进一步研究。 ) ~0 u* u: ?9 C; {/ h2 Q ) I' A0 I% o* ]% Z 2 a' e) E+ a% T' X J+ D2 X* P( S! |7 ` 目前报道的移植方式有局部注射和经血管（静脉或动脉）两种，脑局部注射需要特殊的立体定向装置,有一定侵袭性,易损伤局部正常脑组织,不利于临床应用〔12，22〕；而经静脉移植需通过肺循环,移植物会有部分损失,提高静脉移植的浓度则易导致静脉栓塞。2003年，Willing 等〔23〕运用经颅内直接移植和静脉移植脐血干细胞两种方法都使脑卒中动物模型的神经功能受损症状显著改善，并发现这两种方法的效果没有显著差异。经血管移植操作方便、无需特殊装置,不损伤局部正常脑组织，更便于MSCs移植的临床应用。 . x' F& K# V/ |; g # I9 P/ S% N0 g. r$ }& [6 a+ g( R# L' X% c/ J) i/ N( f
9 R2 |# X1 ^. d MSCs移植后优先迁移到受损部位〔16〕，理论上讲，其具有分化为神经元样细胞从而替代受损细胞的潜能。目前人们多是根据细胞形态和细胞特异性表面标志物如Nestin,MAP2,βtubulinⅢ等来判断植入细胞是否分化成了神经元样细胞，但是还没有充分的证据表明这些分化细胞也具有相应的特定功能。神经细胞的主要功能是接受刺激和传递信息，而其功能的实现又是通过神经冲动的方式来实现的，神经冲动的主要表现形式是动作电位的产生，因此，用膜片钳技术测定神经干细胞的离子通道，可以作为检测诱导后的神经干细胞功能的一种方法,而相关的研究还有待进一步开展。) D, S$ ?; u6 j2 z* V8 L- }7 U2 L/ }
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, z$ u. f. _, f, d' v* | 0 H3 t% Y! E& w% I' |1 U/ F4 O 在神经系统疾病的干细胞移植治疗中，需要考虑的主要风险有：①形成肿瘤。干细胞的无限制增殖和分化则形成肿瘤，如何保证干细胞正常增殖从而防治其成瘤，尚需要深入研究。②干细胞分化为其他非神经元样细胞。干细胞具有多向分化的潜能，保证其定向分化为神经细胞是移植治疗成功的关键，相关研究如前表1所述比较多见。③诱导剂对机体的毒副作用等。目前国外研究主要集中于化学制剂如2－硫基乙醇、二甲亚砜、硫代甘油〔24〕等，但这些诱导剂均有一定毒性，不能应用于人体内。安全有效、对人体毒副作用小的诱导剂有待开发。. g& q0 v' B& O @
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