作者：张为西, 陈松林, 姚晓黎, 卢锡林, 周 琛, 冷 雁, Xingming Shi作者单位：（1中山大学附属第一医院神经科, 广东 广州 510080; 2Institute of Molecular Medicine and Genetics, Medical College of Georgia 30912 GA, USA） # v: w; K4 V7 V7 |, o' `+ w
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S Z/ A ?5 _" `" M0 \, ]1.2.8统计学分析实验数据均以x±s表示, 显著性检验采用双侧检验, P＜0.05表示有统计学意义, 所有结果计算采用SPSS10.0 进行检验分析。 9 P* D2 C l, R8 z) h- l$ c& P, V4 j: a { h* I7 o- W
2结果5 L6 l$ j5 B* W/ S3 `
6 J( V5 }9 C! Z+ R" v' l: S. O2.1MSCs形态学改变相差倒置显微镜下观察, 纯化和鉴定后的MSCs呈长梭形或椭圆形, 类似成纤维细胞, 传代培养时, 约3 h开始贴壁, 约3 d, 细胞增殖, 数量增多, 5～7 d进入对数生长期, 细胞生长速度明显增快, 呈单层贴壁生长。在OS BMP2诱导组诱导培养3～4 d后, 细胞形态由长梭形或椭圆形变成多角形或肥硕梭形, 而OS FGF2诱导组的细胞形态改变不明显。" q! A1 u% C v: K h
8 q" _% X2 S4 j2 v) z2.2BMP2诱导后ALP染色、 ALP活性、 钙沉积和基因表达水平的测定MSCs在OS以及OS BMP2诱导7 d后, 进行ALP染色发现: OS BMP2诱导的细胞染色呈紫蓝色, 颜色比OS对照组更深（图1A）。ALP活性测定显示: OS诱导的MSCs细胞ALP活性为(0.47±0.02) nmol/（μg·min）,OS对照组为(0.36±0.01) nmol/（μg·min）,两者相比有统计学意义（P＜0.05）。OS诱导 21 d后, 对于细胞钙的沉积, Von Kossa染色成黑褐色, OS BMP2诱导组比OS对照组更加明显（图1B）。进行ARS染色细胞钙的沉积为橘红色（图1C）, 定量分析发现: OS BMP2诱导组的A570值为1.29±0.17,OS对照组为0.45±0.05,两者相比有统计学意义（P＜0.05）。在OS以及OS BMP2诱导7 d后, 收集细胞提取总RNA, 采用逆转录荧光定量PCR法检测成骨细胞标志性基因ALP,Runx2/cbfa1,collagen1,osteocalcin, 得出OS BMP2诱导组均比OS对照组显著性增高（P＜0.05,图2）。: h+ C7 R9 i: B3 C9 _
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2.3FGF2诱导后ALP染色、 ALP活性、 钙沉积和基因表达水平的测定OS以及OS FGF2诱导7 d后, 进行ALP染色发现: OS FGF2诱导的细胞染色呈红色, 颜色比OS对照组略深（图3A）。ALP活性测定显示: OS FGF2诱导的MSCs细胞ALP活性为(0.39±0.007) nmol/（μg·min）,OS对照组为(0.35±0.017) nmol/（μg·min）,两者相比有统计学意义（P＜0.05）。OS诱导14 d 后, 细胞钙的沉积, Von Kossa染色成黑褐色, OS FGF2诱导组比OS对照组较明显（图3B）。在OS及OS FGF2诱导7 d后, 收集细胞提取总RNA, 采用逆转录荧光定量PCR法检测成骨细胞标志性基因ALP、Runx2/cbfa1、collage1和osteocalcin, 得出OS FGF2诱导组均比OS对照组增高, 均有统计学意义（P＜0.05, 图4）。图1MSCs在 OS和OS BMP2诱导培养后, 分别行ALP染色（A）, Von Kossa染色（B）和ARS染色（C） # m" U( R& m: j! B9 N3 g* i- F. a) c1 q
3讨论 * n, Y+ ~/ s! A # }; V. W0 f6 f* _在MSCs体外诱导分化的研究中, 细胞来源多选用人、 兔、 大鼠和小鼠的骨髓基质细胞, 然而骨髓基质细胞为混合细胞, 包括成纤维细胞、 上皮样细胞、 单核巨噬细胞、 外膜网状细胞等。因此在诱导实验时, 骨髓基质细胞中有多少数量的MSCs向成骨细胞方向分化不得而知, 因此不同实验条件下所得出的实验结果往往差别较大。然而小鼠MSCs的获得相对于大鼠和人的MSCs更加困难, 特别是MSCs无特异性免疫表型, 纯化的方法多种多样, 获得形态一致、 具有多向分化潜能、 生物学稳定的MSCs比较困难, 所以多数实验选用基质细胞而不是MSCs。但是本研究已经获得了高质量的MSCs,为体外进行诱导分化的研究提供了很好的细胞模型, 其研究结果应该更有价值。: `, _- u z% E, A) V
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BMP2作为TGFβ超家族成员, 是一种重要的成骨调节因子, 有很强的促进成骨细胞分化的功能, 并表达特异性的成骨细胞产物。ALP和钙含量是成熟的成骨细胞的标志之一, 其活性的高低反映了成骨细胞的成熟程度。Runx2/cbfa1在成骨细胞的分化成熟以及骨细胞外基质蛋白的基因表达中起重要作用, 而Collagen1则是成骨细胞合成的特异性胶原蛋白, 其构成骨有机基质的90%, 其含量的多少反映了成骨细胞的成熟状况。当体外培养的细胞融合后, 细胞外基质沉积往往伴随着成骨细胞特异性基因的表达, 如Runx2/cbfa1、 ALP、 Collage1、osteocalcin等, 其中osteocalcin被认为是成骨细胞分化的后期标志, 和成骨细胞的成熟密切相关。在不同来源的骨髓基质细胞众多的诱导成骨细胞研究中, 所得出的结果不甚一致［1, 2］, 这可能与细胞来源、 骨髓基质细胞的混杂性, 细胞来源动物的年龄、 性别、 健康状况, 以及实验所用细胞因子的浓度等因素有关。本实验在OS基础上, 加入100 μg/L BMP2诱导MSCs分化, 数天后细胞形态由长梭形或椭圆形逐渐圆变肥, 细胞突起增多, 部分成多角形, 7 d检测ALP染色加深, ALP活性明显升高, 成骨细胞的特异性表达基因的mRNA水平也明显升高, 21d行Vonkassa或ARS染色显示钙含量明显增加, 说明BMP2在体外可以促进MSCs向成骨细胞方向分化, 该结论和Maegawa［1］、 Varkey等［2］结论基本一致。 7 {- M5 G* Q2 S: p, c2 l2 Y- w: b) s. W' \1 I
FGF2是一种肝素黏合多肽, 通过细胞膜特异性受体结合发挥作用, 具有多种生物活性, 包括影响细胞黏附、 增殖与分化功能。成骨细胞表面存在FGF受体, 故当FGF2与成骨细胞表面受体相结合后, 促进骨细胞和类骨细胞的有丝分裂, 同时对成骨细胞的表型特征和细胞外基质的基因表达发挥调控作用。然而在FGF2诱导骨髓基质细胞的分化实验中, 结果也不一致［2-5］, Varkey 等［2］认为在没有地塞米松只有FGF2诱导时, 不能刺激成骨细胞标志性基因生长, 但能增加ALP阳性克隆数, 低浓度（10μg/L）可以刺激骨髓基质细胞钙结节形成, 而高浓度FGF2可能直接抑制成骨细胞分化的能力。但 Zhang等［4］研究认为无论低浓度或高浓度短时刺激均可增加小鼠ALP克隆数和克隆大小, 以及结节的形成, 而地塞米松并非必需。在本研究条件下, 0.5 nmol/L FGF2诱导7 d后, 不仅ALP染色加深, ALP活性升高, 成骨细胞的特异性表达基因的mRNA水平也升高, 14d行Vonkassa染色显示钙含量增加, 说明FGF2在体外也可以促进MSCs向成骨细胞方向分化, 该结论和Zhang等［4］结论相一致。尽管FGF2刺激不仅对细胞形态的改变不明显, 而且ALP活性升高, 成骨细胞的特异性表达基因的表达量的升高, 钙含量增加都不如BMP2明显, 但在一定程度上是促进MSCs向成骨细胞分化的。 9 {1 r2 g$ ~& G; n5 E! Z0 I 【参考文献】/ }7 [' C3 D+ K4 O4 a/ ~
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