, J8 k; l: Q5 y6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。 / L( [$ f1 m% j2 M; h% u' t) H# |. z% e- p7 C+ ~" n/ @
7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。 % E* X5 m5 H9 Y# D
2 n" a) Q* E6 f2 w$ o% G" Y8 ~* J- C
8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。 9 T+ K& ?5 ~. H V/ P7 o& x3 _6 A , ^$ v4 W$ q) T5 c; p5 @9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。） ' B) Z3 O# q# g9 X1 n2 k % v G2 r4 ?; A2 _9 ]" p7 Z10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。 ) c. |- i2 u8 j
" u. d1 @: [' c6 S) v6 Z9 v
11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。放置20-30min。 $ H( t6 @7 r: _- i( e9 H
- _ X% L! W+ y" E# R2 R12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。 1 h5 o: [1 \ G4 p- ?! Q$ B# E5 O1 A% E* j5 P" {/ h
13. 弃上清，加100ul W5，混匀。加900ul W5，混匀。 8 m& W$ I1 r- V: Z
# Y$ E" m' A& i+ L$ s7 G2 j3 v
14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。 : p' b; g1 n& f* d5 h. _, o- f6 }
* z" F; T5 A) r2 A
15. 荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。 9 s( k% u, J- d" _7 {8 P" l ^1 r3 D7 }- X/ d
Solution Recipes 7 A7 v7 d- |, J2 z
J4 B* d/ g4 |# q9 v! d: [Enzyme solution ( R# j$ _) O1 ~& }' C8 g : q2 @1 J9 |- g" O+ `& R x1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong) 3 m* q& m" ~0 f2 Y& e, h1 N( X; n 5 s" e) p. Q* R; |# }* R1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan) # P; E: `4 R6 Z' b$ L3 V/ y. Y ! Y& w" ?- m9 Y3 U1.09 g mannitol ' R' }1 O z1 Y$ C0 P0 S8 N
1 z* D7 D a' i' M1ml 0.3M KCl 3 Q* b* S9 x9 Y* F. ~2 _) w# G+ X% `: [+ C X
1ml 0.3M MES, pH 5.7 4 b7 p6 Q0 V6 E S& i9 {5 ?
8 A8 P; x+ y, D- n2 B! a: i+ DHeat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding 4 V# f) F+ U/ M* Y
% U3 e( e2 q+ w+ A. }9 v. e1ml 0.15M CaCl2 - h* E2 O' F2 }7 z' `5 }
( E: e0 R2 L' e+ [! q3 N" x" o8 s7 B1ml 0.75mM β-mercaptoethanol 3 K& }( s- N/ o! c2 a# A( m. o; t/ p$ D
1ml 1.5% BSA ; O, e: i) a9 G6 p6 C/ C) x& l4 r! {1 K& D. P2 k% w" V" o V" `
* L4 F# ^5 o/ e; Y' ?9 g% @PEG solution (40%, v/v) ' n" s. T: J; Y# S8 q2 B; L; v - z; @4 Y& K0 h. M# R# b( ]1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!! 6 N" ^) e# q& [% u- d M2 q# j6 P# e r
0.75 ml H2O 0 j$ ^1 m* M5 _2 j
9 q! L; g% l/ W, d
0.625 ml 0.8 M mannitol ( s1 b# Q6 ?6 r4 j$ l* o. [( Q& Z" c5 _" {3 J0 j4 \5 F
0.25 ml 1M CaCl2 & k( \7 ~" @0 K$ H5 r4 P6 ]- @- B
" B, t2 f( c* [+ G' F7 i% I ! h: Q/ y* z3 z5 F4 sW 5 " M4 I( x4 B. @# l, j) l' u" b+ E5 `- V
1000 ml " o8 p& i/ Z+ F5 ]& _" g6 O2 O; D; d1 l: d" M S0 T
154 mM NaCl 9.0 g , H3 s$ U% u: _6 t% r8 G 4 d. q9 `: q7 v4 R125 mM CaCl2 18.4 g : \# ?8 ]- E% {/ C* i" } s1 n 8 z; [& B% T, I. z7 T" N4 @4 O5 mM KCl 0.37 g # v& X r( T: f1 G& [/ T ) @" d# P# d& @5 mM glucose 0.9 g 4 i. `: w0 x* z4 ^2 c" m : X( }6 h& {0 i0 p- c: l& |/ w0 P0.03% MES 0.3 g * g/ P, ~6 I% H+ P! s
w4 c. Q) v' k
pH to 5.8 with KOH 5 a2 v* Y9 B8 j0 R4 y5 r# S9 j - y/ ~) S) l/ [9 kautoclave 20 minutes in 125 bottles ' W5 }9 x) `; ^* i$ e0 @$ S. l5 o1 [+ \+ M7 ~8 C- Z
5 @: m$ @' M7 C* F P @, H9 IMaMg solution # d9 T3 n6 }& Q& z
4 }- G8 {* S* h5 G. \' G% v4 c: ~
100 ml - a2 G! v: ]/ |. C% c) Y/ e# b$ o ~. i' X7 u8 U
15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2 8 {( Y9 Y2 G' k' ]: E, @& B& ?' G8 t' C
0.1% MES 0.1 g : b" V( Q+ E" h. w. c 5 M6 Q# _1 N7 V7 [) s) o: e7 q0.4 M mannitol 7.3 g $ F* \. k/ r. T1 F
" O6 @7 }* C; u3 P4 C' CpH to 5.6 with KOH 4 h0 M. V5 U }' Y" o * f2 M* H4 {# G J. K5 Dautoclave 20 minutes in 125 ml bottles 7 F( c0 \1 Q# V
! d Y: X& ]7 t. H6 V: m; n7 E7 J) N3 x+ k
References 2 D6 B" J% r; g6 W4 K; C, q& @! l% x
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2. Doelling & Pikaard. 1993, Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidly established cell suspension cultures. Plant Cell Reports 12: 241-244作者: sannia 时间: 2010-10-12 19:45