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标题: 请教iPS诱导过程中的问题（有图） [打印本页]

作者: 上官鑫 时间: 2010-9-29 02:04 标题: 请教iPS诱导过程中的问题（有图）

请教各位高手如下问题：（1）mouse fibroblast 诱导过程中，细胞形态会发生变化，慢慢变圆，如图[attach]14524[/attach][attach]14525[/attach]，但是最终不能产生iPS，几次都是这样，而且feeder变的很差。8 f+ q5 O/ x7 W/ ~- k0 n8 h
（2）Feeder和media养ES没有问题，如图[attach]14527[/attach]，但是把诱导后的Mouse fibroblast铺到feeder上，换成养ES的培养基，Feeder不到2天就变的很差很差，不知为何？还望各位高人指点。

作者: 懵懂干细胞 时间: 2010-9-29 10:56

关注中！

作者: mbjane 时间: 2010-9-29 14:31

关注ing

作者: manybit 时间: 2010-9-29 15:12

严重关注，非常有趣，干细胞培养会集中吗？

作者: chengrui 时间: 2010-9-29 15:29

你在诱导过程中使用的病毒可能滴度不够高，也能导致这种细胞形态发生变化，但不能产生完全iPS细胞的现象

作者: shewawa 时间: 2010-9-29 22:56

方便说下fibroblast 的cell line吗？这个是用什么诱导的iPScells？病毒吗？什么病毒作载体啊，还有诱导的时候用了几个factors，三个还是四个。用的transfection的试剂是什么？做病毒的细胞是什么？有没有放其他的东东。上面说的你都要注意的。
在generation of iPScell 的时候，那个virus titer 是很重要的，你有没有进行检测？这个我在第一次做的时候也出现了这个样子的细胞，我们成为PRE-iPS（你的那个可能还没有达到这个程度），这样的细胞会具备iPS的很多阳性指标，但是me-3k27可能是阳性，还有没有development的能力，也很难进行expand。你下次如果再做的时候要想办法提高 virus titer。' l4 n) K! z5 b* y; A
那张图是day10你别急，也可能出现iPS,mouse- iPS （4 factors）十四天会出现 iPS cell的。3 factors更长时间。

作者: shewawa 时间: 2010-9-29 22:58

顺便说下，你的ES细胞培养的真漂亮。看来技术很不错:)

作者: 上官鑫 时间: 2010-9-30 00:54

用的自己取的原代MEF，然后传代到第4代左右用于诱导。包装病毒用的293T，我也想用高级点的包装细胞，但是这个实验室没有，而且用的钙磷瞬时转染。pMXs经典的O，S，C，K诱导。那个ES只是随便养养，想检测一下我的media和feeder有没有问题，这里有趣的事情就发生了，media和feeder养ES没有问题，但是用来养induced MEF，不到2天feeder就变的极差，我也怀疑是不是引入的induced MEF被污染了，但是除了feeder基本上死光光了，induced MEF又能长起来。很奇怪。shewawa说的很对，这些变化的细胞挑克隆根本就expand不了。

作者: cicadacjk 时间: 2010-9-30 14:32

我觉得问题基本可以圈定以下几个：* a' k0 {8 Z$ {1 N
1. 你的293或者MEF有支原体污染，feeder变差就是这个原因，支原体存在基本上是做不出iPS的，必须除去（这个应该是主要原因，其他两个是附加建议）
2. 你用的MEF代数太老了，一般三代以内，P2更好。. w1 `, K+ R# T" _
3. PMX诱导，你附加了什么包装质粒，如果滴度高，六天四因子感染的MEF会长得满盘都是，所以包装质粒，转染技术可能都要提升。

作者: 上官鑫 时间: 2010-10-1 03:57

但是如果有支原体污染，为什么induced－MEF又能长的很好呢？是因为它比feeder抵抗力强吗？其实用普通的media养没有问题，一换成ES media养，feeder就很快死翘翘了。我怀疑是media有问题，就用它养了一下ES，结果ES又能长好。其实我也觉得是支原体污染，因为ES media有20%的血清，正适合支原体生长，是不是降到15%会好些？其实我还怀疑pH的问题，那个ES media配出来就是接近黄色的。
关于代数问题，P4还好啊，以后还要诱导人的，那个都是10代左右了，前途渺茫啊。* c1 g8 P( K/ J1 J. `' @
pUMVC和pCMV－VSVG包装，加上目的质粒，3质粒共转，那个pUMVC是low copy，不好用。

作者: cicadacjk 时间: 2010-10-1 22:27

支原体极有可能在你的293T细胞上，这样你的病毒就带支原体
带了Myc的细胞自然长势良好，只是你这个也不能算长势良好，只是能活能分裂罢了，要不然六天必然密到堆起来。如果有支原体是没有办法的，必须换细胞。不要幻想能除去支原体。6 W3 q- _+ i c+ y
人的细胞代数大点没问题的，十代左右也就中等效率吧。MEF P4基本不行了。
你ES培养基是用FBS吧，没有用KSR吧？一般来说就是用15%的FBS养。3 ]' r) k, `$ h4 k; {
0 t5 }4 n0 J' x; c
建议去找株干净的platE细胞，实在不行找一株干净的293，估计问题就能解决了。

作者: 上官鑫 时间: 2010-10-1 23:00

有道理，但是我用ES media单独养feeder，也是过两天就死了，用ES media同时养ES和feeder就能长的很好，很神奇。

作者: 开心果王 时间: 2010-10-2 22:44

KSR对feeder影响特别大，LZ不是用它养的吧！我看见你的Feeder状态不是很好啊！

作者: 上官鑫 时间: 2010-10-4 06:27

我KSR和FBS for ES的都试过

作者: iyaofying888 时间: 2010-10-4 10:20

代数应该控制在3代以内，media做一下test，并且过滤一下试试。

作者: 大猪小猪落玉盘 时间: 2010-10-4 10:46

建议：从买试剂开始，从头再来！！！！！！！

作者: 上官鑫 时间: 2010-10-5 06:07

media test了放培养箱n天都没有变化，也过滤了试过。我就是不明白feeder用DMEM+10FBS养就挺好的，一换成ES media就变差。

作者: linqun 时间: 2017-6-19 14:18

关注:)

作者: 573639471 时间: 2017-8-6 09:26

楼主现在还做ips么

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