* ~- Z! c# C I$ y4 `5 g4 d 6 U& [- T$ p: e9 g 【摘要】 为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC 。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor, SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31； MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能； MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常； MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论： MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。 - y! P) G6 t+ ^) \ @4 d; L 【关键词】间充质干细胞; 多发性骨髓瘤; 细胞因子 / I5 J0 E E( f* I5 L Biological Properties ofMesenchymal Stem Cells Derivedfrom Bone Marrow of Patients with Multiple Myeloma8 a+ S4 ^0 i9 E" B# Z) X5 W
; v ~( M* a$ ]) X+ n: n ZHU Bu-Dong， REN Jun, WANG Xiang-Yi, LI Xin, NIE Jun: C: u% r' L& y4 E5 ^
8 d P6 m- T4 U( A) C
Department of Oncology， Peking University School of Oncology & Beijing Cancer Hospital， Beijing Institute for Cancer Research, Beijing 100036, China * p) e' M- Y8 P' P0 r: {! K- o( ?: R: \/ _+ Q( k
AbstractThe study was purposed to explorethe role ofmesenchymal stem cells (MSCs)in the pathogenesis of bone disease particularly observed in multiple myeloma (MM), the biological features of marrow derived MSCs from patients with MM have been investigated. Marrow aspirates were harvested from 11newly diagnosedpatients with MMand 5 normal adults and MSCs were isolated and culture-expanded by the cell properties of adherence to plastic flasks, Thephenotype was analyzed by flow cytometric technique. The proliferation of MSCs was observed by MTT assay and their differentiation capacities into osteoblasts and adipoblasts were assessed with lineage-specific histochemical staining. The concentrations of IL-6 and SCF in the culture supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). MSC culture supernatants were collected and MTT assay was performed to evaluate their support on the proliferation of an MM cell line SKO007 cells. The results showed that bone marrow-derived MSCs from MM patients were homogenously positive for CD29, CD73, CD166 and HLA-ABC and negative for hematopoietic cell marker CD45 and endothelial cell marker CD31, the phenotype of which was similar to that of marrow counterparts from normal adults. MTT assay indicated that MSCs from MM patients or normal adults proliferated at similar rates. MSCs from MM patients occupied in vitro osteogenic and adipogenic capacity as those from normal adults. The levels of IL-6 and SCF in culture supernatant were greatly up-regulated in MM patients by ELISA assay. Furthermore, MSC culture supernatants from MM bone marrow displayed enhanced activity to promote the proliferation of SKO007 cells. It is concluded that marrow-derived MSCs from bone marrow of MM patients are normal in their proliferation and differentiation capacities, and myeloma bone disease maynot be ascribed to the differentiation of MSCs while the elevated secretion of IL-6 and SCF mayprovide necessary cues for the survival of malignant myeloma cells.; M- M; M) V. t6 ~% H" Y( {' Y
* G J0 `/ M, z& n Key wordsmesenchymal stem cell;multiple myeloma;cytokine , F( _0 X# ]. N; z' B6 m - O" i' P' ] R8 f 多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）患者呈现特征性的骨质破坏。这种骨质损伤与破骨细胞数量增加，成骨细胞数减少，从而导致骨吸收与成骨之间失平衡有关［1］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是存在于骨髓的结缔组织干细胞，不但可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化，而且是骨髓基质细胞的前体细胞［2］。骨髓基质细胞为骨髓瘤细胞提供了必需的生存和增殖支持，并由此促进破骨细胞的增殖分化，导致溶骨性损伤［3］；而骨髓瘤细胞可通过细胞因子分泌和(或)细胞间的直接接触，引起成骨细胞的凋亡［4］。但是，以上这些病理改变是否涉及MSC本身，抑或MSC的某些改变促进了疾病进程尚不清楚。为此，我们对骨髓瘤MSC的特性进行了研究。# a+ b. Z u& i& V7 e4 G6 b
5 B: b* H: ]! J& A* D, E 材料和方法 9 B0 u6 H; d9 k+ d" e$ |/ M6 @0 B" L4 r% ^. \! g- @6 n! Y5 e: G
材料来源 + h s, W7 A7 k- v3 w5 D+ P& N) Q2 z
11例MM均为初治患者，男7例，女4例，平均年龄59.4岁; IgG型6例， IgA型3例， κ轻链型2例。对照骨髓来源于骨髓象和血象检查正常的健康人，共5例，其中男3例，女2例，平均年龄51.7岁。SKO007 MM细胞株为本研究所传代的细胞株。 ' R% T- C8 k! x' Z/ C5 p, L1 a) P , a# n$ w% z- {% K! K' f& [6 e0 a% v1 g 骨髓MSC的分离和培养: R- j F0 M+ D, H, i- z
5 S$ O3 ^) \; e$ g
按参考文献［2］的方法，取肝素抗凝的骨髓，α-MEM稀释2倍后Percoll梯度密度离心收获单个核细胞。将细胞接种于含10%人骨髓MSC专用培养血清的α-MEM中（血清为Stem Cells公司产品），培养48小时后去除非贴壁细胞，继续培养至贴壁细胞约80%融合，收集培养上清于-70℃冻存备用。0.05%胰蛋白酶消化传代培养。第3代细胞用于以下实验。 * Z# I0 s# n$ R! ~+ u! Y# s# H7 Q& e% Q) R5 k
细胞免疫表型分析 ' B* i2 J9 A6 v7 z) E ' U% p# j p* l# j$ A5 a 胰蛋白酶消化收集MSC，加入FITC或PE标志的小鼠源抗人CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166、HLA-ABC和HLA-DR单克隆抗体（eBioscience公司产品），室温下避光反应30分钟。用PBS洗涤2次后，FACSCalibur (Becton Dickinson， USA)收集细胞参数，用流式细胞仪检测，WinMDI 2.9软件分析结果。 1 D+ h5 s3 F; s& ?9 a9 v/ \ 3 ]) f l) y {* E 增殖能力的MTT法测定 % E' j3 u6 v) u1 e9 ^2 _+ @* W2 r7 G( ]
收集MSC，按750个细胞/孔接种于含MSC完全培养液的96孔培养板中，每组6孔；将SKO007细胞按1000/孔接种于不含血清的RPMI 1640 培养液的96孔培养板中，培养体系中分别加入10%、20%和40%的MSC培养上清，每组4孔。细胞培养72小时后加入10 μlMTT（1 g/L），继续培养4小时。离心去除培养液，加入二甲亚砜裂解细胞，以未加MTT孔为本底，570 nm波长下测定OD值。 9 C' t9 g$ k# J! A2 V W1 m! B9 f1 Y1 j, N2 q K, ~
多系分化的鉴定2 Y6 ^; u- _. j, U0 b) {" b9 p5 E
* }4 i1 k! t' Y: K6 L7 S
成骨分化将细胞按5104/孔接种于6孔培养板，或1104/孔接种于24孔培养板中，加入地塞米松（10-7mol/L）、维生素C（50 mg/L）和β-磷酸甘油（10 μmol/L），培养12天，期间换液2次。应用白细胞ALP染色试剂（Sigma公司产品）进行碱性磷酸酶原位染色。9 x& l# t8 A' T& R3 i1 d+ y" b
$ M+ j. L. ~0 e1 g1 n3 Q 成脂肪分化将细胞按2104/孔接种于24孔培养板中，次日加入地塞米松（10-6mol/L）、IBMX（0.5 mmol/L）和消炎痛（10 μmol/L），连续培养7天后去除培养基，用PBS洗涤2次后多聚甲醛室温固定1小时，1%油红O染色，光学显微镜下观察。 1 V6 C, X* y5 T! T- y9 a4 ?1 T% O
MSC的细胞因子分泌功能测定' z: b& G6 A$ c# s
+ E4 `( j% q. V4 Q/ k# K. z 消化传代细胞培养至贴壁层致密时，更换无血清的α-MEM，培养48小时后收集培养上清，于-70℃冻存备用。按照试剂盒（Bio-Rad产品）操作说明，应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定，依据由重组人白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor, SCF）（Peprotech产品）所作的标准曲线，测定培养上清IL-6和SCF浓度。' g2 [- t+ @0 X& g" [$ q
) s% [+ v0 i- P
统计学处理 * }3 r- E |2 J. D$ z) ^2 k j* x h- @1 @
试验数据以平均值±标准差（±SD）表示，以t检验进行数据分析，P值 . S' c& Q; e' z+ E4 f# V ) D4 l& e; X% y- u! N) d5 z 结果 p6 p1 E% r0 f9 I+ u$ G: r3 Q L1 ?$ Q
MM患者与正常人骨髓MSC免疫表型的比较 2 g7 v3 U/ Q; I 4 V9 E4 \# W4 q a) B7 j$ _( X 体外培养的MM患者和正常人骨髓MSC均一地表达间充质细胞标志CD73和CD166，表达黏附分子CD29，不表达造血细胞标志CD45和内皮细胞标志CD31。此外，细胞表达HLA-I类分子(HLA-ABC)，不表达HLA-DRII类分子。MM骨髓MSC表型与正常人来源MSC相似, MM患者骨髓MSC表型无改变（图1）。 $ E) Q$ x! b- i- p3 v8 L' X( n( [5 A, G% y1 l
MM患者骨髓MSC增殖能力分析0 z4 L0 ~' S2 @3 U
! C: ]( L9 r+ n! s" V1 f
利用MTT法检测第3代细胞增殖速率。MM患者骨髓MSC与正常人骨髓MSC组比较没有显著差异，OD值分别为0.46±0.11与0.39±0.08 (P>0.10) ，MM患者骨髓MSC增殖能力正常（图2）。/ g! R" a- t% w8 f7 w8 [, A
; V2 K9 X0 I/ O/ z' L( V; e MM患者与正常人骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力比较. I0 w, W. Z6 D1 w
% A0 j/ a) L) ~% X6 L' _5 K MM患者和正常人骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，细胞形态均发生了明显的变化，部分细胞由纺锤形转变为多边形或不规则形状；12天后经NBT-BCIP染色显示细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，MM患者骨髓与正常人骨髓组细胞显色强度比较无明显差别（图3A、B），显示MM患者骨髓MSC成骨能力并没有减低。应用成脂肪诱导体系作用7天，油红O染色显示两组细胞体外成脂肪性能未见明显差别，MM患者骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力正常（图3C、D）。 + T. M0 |: R( j6 a : j9 N% r6 G: {8 _$ P1 R- }5 i MM患者与正常人骨髓MSC的IL-6和SCF表达量比较& ~3 f3 A# i. u9 u- v! Q
. y" d: G8 q1 {2 K( _8 ~
1106 MM患者骨髓MSC细胞48小时分泌的IL-6总量显著高于正常人骨髓MSC，分别为(9.36±2.11)ng 和(4.72±1.64)ng（P ' [. y5 C2 c; _& I! @6 i0 L" y& N" @
MSC培养上清对SKO007细胞的增殖支持作用 3 N5 q( q/ W" S2 f5 @" f 4 O- O$ N# G7 P) R% M. T; s) U. q 将SKO007细胞用无血清体系培养，加入不同浓度的MSC培养上清，72小时后MTT法测定细胞活力。结果表明：未加条件培养液组大部分细胞死亡；加入10%和20%条件培养液后，两组细胞增殖能力无差别；浓度升至40%时，MM患者骨髓MSC培养上清明显促进SKO007细胞增殖，两组比较差异有统计学意义（P 0 X5 z& }# n/ N" T* e4 Q 4 b1 C* p/ ^0 m6 }( V# f' G. U" Z% Z$ W 讨论 ( O0 ?* ?& @) i0 ^' t) N& ]& V8 ~( E
MM是B细胞克隆性疾病，肿瘤细胞刺激骨吸收，促进血管形成，导致溶骨性骨损伤，即使化疗成功实施后，骨损伤仍然存在，提示骨髓中成骨细胞的干细胞—MSC可能存在本质的异常。MSC是存在于骨髓的结缔组织干细胞，是骨髓基质细胞的前体细胞。骨髓基质细胞与骨髓瘤细胞相互影响，促进破骨细胞的增殖分化和成骨细胞凋亡。为此，我们分离培养了初治MM骨髓MSC，并与来自年龄相近正常人骨髓的MSC比较，观察MM患者骨髓MSC是否存在生物学特性的异常。结果表明，体外培养的这两种来源MSC表型一致，均不表达造血细胞和内皮细胞的标志，提示MM血管形成可能与MSC向内皮细胞的分化无关。MM患者骨髓MSC不表达HLA-DR，提示MM病人骨髓微环境中炎性因子或相关的调控因素使MSC维系了固有的表型。MSC具有很强的体外增殖和多向分化能力。MM病人骨髓中成骨细胞数量减少［4］，可能与 MM骨髓MSC的增殖分化能力有关。本研究采用MTT法检测MSC细胞增殖速率，结果显示MM骨髓源MSC增殖能力与正常骨髓源MSC比较没有显著差异，提示MM病人的MSC增殖能力正常。在体外，MM骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，具有正常的体外成骨能力，且与正常人骨髓MSC相似; MSC体外成脂肪能力与正常骨髓MSC亦相当。本研究表明，MM病人MSC体外增殖分化能力维持在正常水平，骨髓瘤细胞没有改变MSC固有的自我更新和多向分化能力。然而研究已发现，骨髓瘤细胞与成骨细胞系共培养后成骨细胞株Runx-2基因表达下调，从而抑制成骨细胞向骨细胞分化成熟［5-7］。因此，骨髓瘤骨疾病涉及的病理改变可能发生于成骨细胞阶段，而与MSC分化能力无关。研究已经表明，MSC和骨髓基质细胞可分泌G-CSF、GM-CSF、VEGF、SCF及IL-6等多种细胞因子［3，8, 9］，这些因子相互影响，形成网络调节骨髓瘤细胞的生物学特性［10］，促进骨髓瘤细胞增殖和存活。人骨髓瘤细胞也表达成骨细胞特异性转录因子Runx2，并分泌骨桥蛋白（osteopontin, OPN）［7］。研究发现OPN也与胃癌的侵袭转移有关［11］。骨髓基质细胞分泌IL-6等细胞因子，促进骨髓瘤细胞分泌与成骨发育相关的因子，以抑制成骨新生，促进骨溶性损伤［3,12］。骨髓瘤细胞是骨髓中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）的主要来源。bFGF促进骨髓组织新生血管形成、刺激基质细胞分泌IL-6［13］。人骨髓MSC也表达bFGF受体。骨髓瘤病人MSC细胞分泌异常可能与体内异常细胞因子网络调节有关。本研究发现，在体外，MM患者骨髓MSC分泌的IL-6和SCF量明显高于正常人骨髓MSC，而细胞培养上清促进骨髓瘤细胞SKO007增殖。MM患者骨髓MSC表型和增殖分化功能与正常MSC相当，这提示骨髓MSC在MM病人体内受到骨髓瘤细胞的直接刺激作用后，高表达IL-6和SCF，并以旁分泌的形式维系瘤细胞的恶性表征，从而间接影响成骨和骨吸收过程,这可能是骨髓瘤并发骨疾病的原因之一。: k/ s2 G/ a2 z
7 t& E5 n2 A. R: W) q' K# y 总之，多发性骨髓瘤病人骨髓MSC生物学性状与正常骨髓MSC比较无明显变化，而其高表达IL-6与SCF可能与骨髓瘤细胞的直接作用有关。本实验研究了骨髓瘤MSC的表型、增殖分化、功能等特征，其结果为MM骨损伤的发生机制及其干预治疗等的研究提供了重要信息。 + ?" A8 y' s. E1 ~" _ 【参考文献】 b& t {8 B9 J# ?$ A 1 Barille-Nion S, Bataille R. New insights in myeloma-induced osteo- lysis. Leuk Lymphoma, 2003; 44:1463-1467) G* z2 j5 P1 n- E
) S$ {' v; ~# P o' r
# \5 X4 E' ?& U9 A; k 4 {$ T6 o( |* S6 e 2 Guo Z, Yang J, Liu X, et al. Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow. Chin Med J（Engl）, 2001; 114:950-953) t. e- M. p: e" x
) Y) p* c$ J( a5 n5 B , l8 t+ x+ t/ G/ q' p 2 f/ m$ C) \- Y! U w' H% @% h 3 Roodman GD. Role of the bone marrow micro environment in multiple myeloma. J Bone Miner Res,2002; 17:1921-19253 t' {8 o6 ?# M3 `/ \, {
. @4 Q* `" c# j4 l& { 7 N$ H4 k) r1 G# v8 h5 O9 v- o 4 b; J; u+ G2 W& z" g 4 Silvestris F, Cafforio P, Calvani N, et al. Imparied osteoblastogenesis in myelomal bone disease: role of upregulated apoptossis by cytokines and malignant plasma cells. Br J Haematol, 2004; 126:475-4868 @! n8 |) ^& s- O" L1 {% b) z
- n& E* B; L |: ?1 [7 ^8 G- J0 X5 D6 @+ z6 g3 S* y0 u
$ z" y2 y: G$ z" R( w$ u& e, ~! d 5 Giuliani N, Colla S, Sala R, et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood, 2002; 100:4615-46215 i3 A, L! E+ M" q" S- b$ [6 u3 S
2 _4 t( P9 B/ b( y
l/ Z+ L! o3 k4 R, t3 V8 j I+ l' }3 T
6 Giuliani N, Colla S, Morandi F, et al. Myeloma cells block RUNX2/CBFA1 activity in human bone marrow osteoblast progenitors and inhibit osteoblast formation and differentiation. Blood, 2005; 106:2472-24834 ]+ [8 o! h! V# X. W5 n$ `
' G8 y. M7 p+ y* ~" F2 X1 A1 y9 f; }) E7 W
2 q6 g9 ] ^; \/ {6 T& F; i" @& F
7 Colla S, Morandi F, Lazzaretti M, et al. Human myeloma cells express the bone regulating gene Runx2/Cbfa1 and produce osteopontin that is involved in angiogenesis in multiple myeloma patients. Leukemia, 2005; 19:2166-2176 , E: J; `3 T# K1 k! C: T) E8 K : u8 u- N2 u7 Z2 O; C9 ^0 H1 O: V% S
5 D6 ]) R) l2 X1 ]9 L( U R9 O
8 Tocci A, Forte L. Mesenchymal stem cell: use and perspectives. Hematol J, 2003; 4:92-96 ! L G. p7 Y% C) Y9 U5 |0 k r0 S& v! a" Q( z+ S
+ g) G, G% M7 I/ o 6 Y& w$ J& X/ m4 F: x$ h/ B# U) ?+ S 9 林如峰, 陆化, 刘澎等. 蛋白酶体抑制剂PS-341对多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞多种细胞因子表达的影响. 中国实验血液学杂志，2006；14：61-64. - h6 k5 n8 q) G1 Q / I* j3 s" {* }9 n1 |" ~' q! G- B; C* X$ s5 m. |7 C0 N7 O
! [% |6 T. R1 a
10 Lauta VM. A review of the cytokine network in multiple myeloma: diagnostic, prognostic, and therapeutic implications. Cancer, 2003; 97:2440-2452 ' ^7 I5 v* b" y% k8 n- S+ I- g X! X7 @& u+ z/ b: V
& C" r' t2 K @4 d& _9 n% S
V% {$ Z$ Z- J* H7 R, f2 l; r+ H 11 张东涛,袁静,杨力等. 骨桥蛋白在胃癌中的表达及与胃癌侵袭转移的关系. 中华肿瘤杂志,2005; 27:167-169+ q* B/ j2 J5 I0 J% ~1 j. b, f1 {
0 t1 y0 ^3 R4 R6 T F$ H& p4 F5 G
/ y2 p# w& @4 z0 y2 P$ }
* q' r9 k$ P/ Z2 t
12 Karadag A, Scutt AM, Croucher PI. Human myeloma cells promote the recruitment of osteoblasts precursors: mediation by interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor. J Bone Miner Res, 2000; 15:1935-19435 F8 P2 b% d; k/ e+ C0 |- ^, T1 @
5 c0 u" t9 E1 E0 `9 b/ I% J3 u W! c3 @ W% K
+ i% ~/ z0 l" F+ l
13 Bisping G, Leo R, Wenning D, et al. Paracrine interactions of basic fibroblast growth factor and interleukin-6 in multiple myeloma.Blood, 2003; 101: 2775-2783 / ^/ s, Q; u ~* R$ V: y! w; C8 ?6 t( p2 P
基金项目：本课题为教育部高等学校优秀青年教师科研奖励计划资助项目,编号 TRAPOYT99－16作者: 青竹 时间: 2009-3-6 18:04