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标题: 请教做Feeder的问题！ [打印本页]

作者: zhaoyan1983 时间: 2010-10-7 20:10 标题: 请教做Feeder的问题！

请教每次重新铺Feeder时都需要重新拿出一管MEF解冻吗？6 y) d( }' {* s K3 v
然后用第二代做Feeder吗？! ^ Y$ R0 \3 z* g, B( A
感觉这样做好麻烦，而且很浪费MEF,请问正确的做法应该是什么？请详细说明，谢谢！

作者: shewawa 时间: 2010-10-7 20:22

有文章说feeder年轻的会更好，更容易维持小鼠的干细胞，如果你很喜欢的话。要是没有那么严格的要求的话，MEF可以Passage到第五代，所以在这个过程中你能做出很多feeder之后再用药物或者是放射线使他停止生长，冻存，下次留着用。

作者: haijing12585 时间: 2010-10-7 21:21

回复 1# zhaoyan1983 . N: U W+ [& B) R( u- e" e/ o
这个东西是没有办法改变的！

作者: 张也行 时间: 2010-10-7 22:18

刚复苏的细胞一般都会有许多死细胞，所以一般要复苏后培养一段时间后在做饲养层，一方面可以洗去死的细胞，另一方面可以确定你的细胞数量，这样才能确定你复苏的细胞能做多少饲养层。

作者: zhaoyan1983 时间: 2010-10-7 22:44

不是很明白，用丝裂霉素处理过的Feeder还可以再一次冻存吗？; W+ B1 i9 B& m' ]
但是如楼上所说，复苏后会出现部分死细胞，那么细胞的数目就会出现偏差了吧，
那假如我在冻存之前的一管刚好够铺一个皿的话，那么如果冻存之后死了一部分，那该如何处理啊？

作者: zhaoyan1983 时间: 2010-10-7 22:47

主要是想问是不是每次重新铺Feeder时都需要重新拿出一管MEF解冻？
请做过的高手给一个大体的实验步骤！！！！！！！
另外细胞计数是在哪一步啊？

作者: supergama 时间: 2010-10-7 23:29

1、丝裂霉素处理过的MEF可以冻存，但死细胞会有些多，对ES的支持会差点。7 z3 p& ^/ C/ i: t0 N3 H" ]& r+ i
2、复苏后直接铺板细胞数量不够可以适当补充，但通常的做法是贴壁过夜后再消化计数铺板。2 Y2 k5 V* J( J) B# T+ L
所以通常P0-3代细胞冻存，P4-5代处理后用于实验，实验多余的处理过的MEF则冻存。使用时主要根据自己的实验安排来定，较大的实验可复苏早代数如P0，这样MEF与ES可平行培养一段时间。小实验，时间不长可复苏丝裂霉素处理好的MEF用于实验。

作者: 张也行 时间: 2010-10-8 11:54

回复 7# supergama
j5 E8 M6 r( w. L* f- E1 m% e, K& T

你说“复苏后直接铺板细胞数量不够可以适当补充”请问怎么补充，直接在feeder少的培养皿中加入适当的MEF就可以了吗？

作者: 张也行 时间: 2010-10-8 11:59

回复 6# zhaoyan1983 ( P( C9 i1 `2 W/ V. p6 q7 [

哎这些东西你在网上找一下就有了。
有个网友曾经提供了一个，还行。这个没有太严格了。

附件: 胚胎干细胞饲养层的制备.pdf (2010-10-8 11:59, 113.91 KB) / 下载次数 40
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MTQ4OTV8MTY3Yzk2NTh8MTc0Nzk5Mjc1OXww

作者: supergama 时间: 2010-10-8 12:15

回复 8# 张也行 9 d, j; E' S& a9 l
是的，加适当的MEF就好，关键是要尽量晃匀。

作者: zhaoyan1983 时间: 2010-10-8 14:44

请做过的高手能给写一个大体的实验步骤，细节上的，网上的文献没有细节的东西！0 W( m5 ~  P% ~: f4 T; a
谢谢各位，现在知道了原来处理后的feeder还可以再次被冻存！
但是冻存后的feeder从复苏之后开始，应该怎么处理？从ES被从老化的Feeder上传到新的（就是前面提到的新复苏的feeder）上之前，都有哪些步骤？[/b]请详细说明！十分感谢！
作者: zhaoyan1983 时间: 2010-10-8 14:48

回复 7# supergama 3 P* S  L+ @+ P8 i* i

+ H& w. N/ {% A复苏后直接铺板细胞数量不够可以适当补充，但通常的做法是贴壁过夜后再消化计数铺板。是用PBS将没有贴壁的死细胞洗掉了就可以吗？过夜计数之后的feeder可以直接用吗？还用不用再培养几小时？
作者: supergama 时间: 2010-10-8 18:18

1、复苏处理好的MEF到培养瓶中，贴壁过夜。# J& Z$ m4 ]% q$ l9 a
2、去液，PBS洗涤1-2次。
. t9 q! @' q/ D. ?' Q" _& C6 y3、胰酶消化分散成单个，计数后铺明胶板。
# V3 s  W+ }' j- P8 `% G4、贴壁4-6小时后可以用于接种ES。
作者: lucillelee 时间: 2010-10-8 21:56

个人经验，MEF消化后再贴壁培养（不铺明胶），一般至少要6个小时才贴壁完全
作者: lxl069 时间: 2010-10-9 13:12

不需要，一次可以传到3，4代，然后冻存
作者: cony 时间: 2010-10-11 13:09

我一直都是取完MEF后，传到第三代左右丝处理，然后冻存，虽然用时再复苏在明胶包被的培养板上。复苏时是会死一些，所以在冻存的时候密度要比要用的密度稍大些。

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