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标题: 养的鼠胚胎干细胞总污染 [打印本页]

作者: 宇光十色 时间: 2010-10-13 20:23 标题: 养的鼠胚胎干细胞总污染

我养鼠的胚胎干细胞没多久，最近总是出现大肠杆菌的污染，估计是操作过程有问题，特向各位大侠请教！! n6 U S4 u! Q5 v& p4 |0 D5 g; J" }
请热心的大侠传授下经验，越详细越好，谢谢！

作者: qianqianlaile 时间: 2010-10-13 20:53

培养基中可以加入双抗，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。链霉素1U=1微克。一般医院的青霉素为80万U/瓶，链霉素为1g/瓶。
一般市售青霉素为80万单位/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中；链霉素为1g/瓶，将其溶解于5ml中。- p2 y4 [8 z5 H5 I* e
可分别取4ml青链霉素配成混和液，这样青链霉素的浓度各为10万单位/ml,然后将8ml溶液稀释十倍，青链霉素的浓度各为1万单位/ml，用时可向培养液中加入1%的双抗，即可达到终浓度为100单位/ml.

作者: qianqianlaile 时间: 2010-10-13 20:54

也有已经添加了双抗的培养基出售，和普通培养基价格一样

作者: supergama 时间: 2010-10-13 20:54

何以见得是大肠杆菌的污染？跑过PCR吗？建议先把抗生素撤了，把污染源找到，一个环节一个环节的找，该扔的扔，该灭菌的灭菌，不行的话实验停下来重新配一套体系。一般mES培养中最容易出问题的是MEF，而最要小心的是支原体等隐性污染。

作者: 懵懂干细胞 时间: 2010-10-13 20:58

你好！其实在我们干细胞之家里面已经有很多关于细胞污染方面的帖子了！你可以在搜索栏里面搜索一下参考参考！
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这里面有一些相关知识希望对你有帮助！

作者: juan880929 时间: 2010-10-13 21:11

Gibco已经有100x浓储的双抗，可以买过来加一下，再有就是看看是不是培养基有问题，总污染同一种菌一般情况下是培养基的问题。再有就是看看是不是本来冻存的ES就有问题。可以用已经配好的培养基养一下成纤维细胞，如果还污染就是培养基问题，如果不污染了就是本来冻存的细胞有问题。

作者: cony 时间: 2010-10-13 22:29

1，培养液配制过程中有无问题？这个很容易解决，开新的就是了。
2，接种ES前MEF是否有问题？1 n/ y' e3 {( K8 \5 E- S5 ]$ H
3，操作，器械，
4，实验环境，感觉这个比较重要，前段时间我们也总污染，后来发现是别人在取样时带菌进来了，彻底清洁消毒，2 L2 y \9 c% M: _$ I
5，培养箱，至少一个月消毒一次，
个人觉得细菌污染还是比较易控制的，最麻烦的要数支原体和真菌。

作者: 宇光十色 时间: 2010-10-13 22:41

回复 2# qianqianlaile

% Q) n. E) ]& Z: j) G' @6 b! p
谢谢！培养基中一直都加入了P/S，但还是没有扛住呵呵

作者: 宇光十色 时间: 2010-10-13 22:44

回复 4# supergama

恩在高倍镜下看是杆状小动物在游动，师兄说是大肠杆菌。

作者: 宇光十色 时间: 2010-10-13 22:44

回复 5# 懵懂干细胞

非常感谢！

作者: 宇光十色 时间: 2010-10-13 22:46

回复 6# juan880929

谢谢~~·

作者: 宇光十色 时间: 2010-10-13 22:46

回复 7# cony 5 g& B% Q, A$ e, G* G$ H3 {
7 g' P H3 v; ~: v/ d5 n
: w/ s( Y* ?% m% l/ b" W
谢谢！受教了

作者: cony 时间: 2010-10-13 22:51

双抗只有预防作用，对于已污染的，效果不大

作者: zhbshi998 时间: 2010-10-14 22:10

我在养小鼠胎儿成纤维细胞的时候也发现过有这样的污染，不过不是很确定到底是什么东西。只发现过一次。

作者: w1986725 时间: 2010-10-19 20:02

清理一下培养环境试试

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