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标题: 关于细胞冻存的一个问题，不知大家平时有没有留心过？标题留长一些，欢迎大家热烈讨论 [打印本页]

作者: deron 时间: 2010-10-15 16:14 标题: 关于细胞冻存的一个问题，不知大家平时有没有留心过？标题留长一些，欢迎大家热烈讨论

昨天犯了一个很严重的错误，在分离出血液的单个核细胞以后，装入冻存管中放进4℃冰箱，结果忘记放入-80℃冰箱，直到今天早上整理试剂时才发现，这时已经过了18h。此时冻存管中的细胞已经沉到底部，冻存液中也有类似溶血的现象出现。
想请教大家，这样的细胞活性还会有多少？% y- s$ W: K! Z: T P
' S" a; j$ Q; _( p, x
今天早上上网查阅了相关资料，发现在冻存的4℃平衡这一步，大致有：' _$ ?6 @1 W L" P3 Z% M4 { U: M
1.4℃平衡半小时，投入-80℃冰箱
2.直接用冷的冻存液悬浮细胞，投入-80℃冰箱; w) L6 |/ K" z3 `' x3 e
3.4℃、-20℃、-80℃……不赘述6 K* I+ \7 W! x! P- S
4.4℃过夜，投入-80℃0 W) R+ y5 B4 ?# `0 Z5 p& ?/ l
5.程控降温仪……不赘述
看到第四种方法时我差点没跳起来，敢情这就叫歪打正着误打误撞？过一段时间细胞复苏的时候用台盼蓝染色检测一下细胞活性，届时把结果发回来。

作者: wjmkg 时间: 2010-10-15 19:45

这样做应该是可以的

作者: wjmkg 时间: 2010-10-15 19:46

这样做应该是可以的

作者: daviddow 时间: 2010-10-15 19:47

上次我也是这样，放在-4°忘了，后来直接离心，清洗，细胞都没有存活。我分析的原因是：在-4°细胞依然处于存活状态，这是由DMSO，细胞毒性大，所以细胞都死了。

作者: 267318024 时间: 2010-10-15 19:47

学习下，还不知道呢！

作者: djj01 时间: 2010-10-15 21:13

我想需要再次验证反复验证，偶然的事件往往多次验证才成为科学吧。。。也有可能-4°过夜只是一个必需条件，是不是还夹杂了其他的原因？有待探讨。。。

作者: djj01 时间: 2010-10-15 21:17

我想需要再次验证反复验证，偶然的事件往往多次验证才成为科学吧。。。也有装入冻存管中放进4℃冰箱再放入-80℃冰箱只是一个必需条件，是不是还夹杂了其他的原因？有待探讨。。。，

作者: sfk06 时间: 2010-10-15 21:30

估计会有部分存活，但可能会有大部分细胞死亡。DMSO可能会破坏细胞膜

作者: haibara007007 时间: 2010-10-15 22:52

估计活性不会很高5 X( y* J ]. \4 x7 {4 F7 A
等待楼主的结果

作者: deron 时间: 2010-10-16 08:20

回复 4# daviddow
) Q% [7 [& V! Z% C4 G* @
5 h& q" d- X* p& w
话说4℃的时候，DMSO对细胞的毒性已经比较弱了

作者: deron 时间: 2010-10-16 08:21

回复 9# sfk06 3 M. B* U" O* J

我请教了一下老师，他也是这个观点

作者: luoziwei 时间: 2010-10-16 09:59

期待楼主积极的阳性结果，呵呵。

作者: djj01 时间: 2010-10-16 11:14

waiting for your result!

作者: tingwuyu 时间: 2010-10-18 13:50

我想细胞能存活50%就算是不错了

作者: deron 时间: 2010-10-18 20:49

回复 15# tingwuyu

9 J2 i/ s; Q2 K( D6 |
好吧，我愿意跟你赌一下——70%~~~几乎接近正常冻存的成活率了

作者: deron 时间: 2010-10-20 12:52

今天解冻细胞，台盼蓝染色结果还不错# I7 T& k# d! T( l6 s

# N* n6 \" j+ j& n7 m- u* u
目测的成活率至少也有60%以上吧，接近70%——看来4℃过夜再放入-80℃的方法是可行的

图片附件: Image9.jpg (2010-10-20 12:49, 122.94 KB) / 下载次数 118
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MTU0Njd8MzU2NmRjODd8MTc5MzExNTM1Nnww

作者: hawkyiger 时间: 2010-10-21 09:50

作者: deron 时间: 2010-10-26 14:24

今天把冻存的另一管复苏离心重悬后目测了一下成活率，跟上一次差不多。再次证实确实是可行的。

作者: deron 时间: 2010-11-29 17:42

本以为这个意外就这么结束了，前一阵子把这个结果做了一个简单的PPT，有人看了之后提出了质疑，他说缺一个对照试验。仔细检查发现的确，自打接触细胞以来接受的很多都是上级老师的经验，自己新做的东西比较少。! Z! l& C! X- D
两周前进行了一次复苏的台盼蓝染色，发现拒染率在80%之上，甚至我们的主管老师提到成功的冻存复苏率应在90%之上。
万恶的对照，万恶的惰性……
好吧，如果再有机会，我会补上实验。如果大家有知晓的，请帮我在下面补上结果。

作者: deron 时间: 2010-11-29 17:42

本以为这个意外就这么结束了，前一阵子把这个结果做了一个简单的PPT，有人看了之后提出了质疑，他说缺一个对照试验。仔细检查发现的确，自打接触细胞以来接受的很多都是上级老师的经验，自己新做的东西比较少。, Y3 K% c; p, x! S2 t1 A, Z
两周前进行了一次复苏的台盼蓝染色，发现拒染率在80%之上，甚至我们的主管老师提到成功的冻存复苏率应在90%之上。
万恶的对照，万恶的惰性……
好吧，如果再有机会，我会补上实验。如果大家有知晓的，请帮我在下面补上结果。

作者: 呼吸 时间: 2010-11-30 09:23

dmso毒性很大，4度过夜很危险的，正常应该-80度异丙醇过夜或者用程序降温仪。

作者: deron 时间: 2010-12-1 16:09

回复呼吸的帖子7 p; l m1 t' p! [

异丙醇过夜？是指用异丙醇做冷冻保护剂吗？步骤是什么啊

作者: vae有何不可 时间: 2010-12-8 14:27

如果活性不高的话基本是DMSO对细胞的毒害造成的，但是DMSO在整个体系中的比例少于10%时，其对细胞的毒害会减少很多的。。

作者: crystal 时间: 2010-12-9 20:13

我上次冻存的时候，因为下午自己墨迹担误的时间，后来只在-4度冰箱里放了半小时就到5：30，那老师因为忙着要走，所以直接就给我放进液氮里，并且告诉我他一直都是这样做的！不知道他是不是在安慰我！

作者: chuanbaozang 时间: 2010-12-10 09:16

怀疑你的这种冻存的效果，期待你的切身实验结果

作者: lunyuyuanxj 时间: 2010-12-10 17:43

我也刚做了一次这样的事，但在4度放置的时间要短些，最后的结果90%以上的细胞都死了

作者: sun_happone 时间: 2010-12-13 21:21

可能每种细胞不一样，不能一概而论吧，稍微顽强一点的细胞或许还能存活久一点，脆弱一点的放在4度冰箱这么长时间当然要死掉了。

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