作者：彭卫斌， 许文荣， 王冬青， 王 虹， 严金岗， 刘 蓉作者单位：江苏大学医学技术学院医学影像系，江苏 镇江 212013 $ j" t \. p2 c/ g
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- ]6 K2 q! `9 B2 k; M; h + d9 F- F2 Q0 G 【摘要】 目的： 应用磁共振成像（MR）评价移植骨髓间质干细胞对梗死区心肌和血管再生的改变情况。方法： 抽取香猪骨髓，体外分离骨髓间质干细胞，经5氮胞苷（5aza）转化。结扎香猪冠状动脉左前降支，经冠状动脉左前降支和梗死区注射骨髓间质干细胞；对照组注射培养液。3周和6周后，采用TurboFLASH序列行MR首过灌注及延迟成像扫描，绘制左心室各壁心肌信号强度-时间曲线，分析病变心肌信号-时间曲线特点。结果： 对照组首过不强化，延迟扫描信号强度高于正常心肌，曲线上升时间、上升斜率、峰值时间和对比增强率明显低于正常心肌，峰值信号强度仅为正常心肌的（52.5±11.0）％。干细胞移植组首过及延迟均强化，延迟扫描时病变心肌信号强度高于正常心肌，信号强度-时间曲线仅曲线上升时间延长，峰值信号强度可达正常心肌（90.5±9.2）％。结论： MR扫描灌注及延迟成像扫描安全无创，结果准确可靠，能直接反映干细胞移植后心肌再生及血流再灌注的情况。 . z. l3 I. l* ` 【关键词】干细胞； 心肌梗死； 移植； 磁共振成像 - Q8 X ` p3 J- C Assessment of myocardial perfusion using MRwith myocardial infarction after transplanting mesenchymal stem cells - w1 B y& V6 S k2 a w q% C& h+ N9 m* y. C: Y& s
PENG Weibin， XU Wenrong，WANG Dongqing， WANG Hong, YAN Jingang, LIU Rong, Q9 M$ D9 l/ m+ k
5 E! u2 P. A" B (Department of Medical Imaging, School of Medical Technology,Jiangsu University,ZhenjiangJiangsu 212013, China) 6 I& h6 B2 y6 P2 w 1 C; U# e% M# L4 \9 r/ D4 r3 R ［Abstract］Objective: To evaluate transplanting mesenchymal stem cells(MSCs) effect on myocardial infarction using MR.Methods： Drew outbone marrow of pig and separated MSCs in vitro,conzerting with 5aza. After ligating left anterior descending coronary artery (LAD), infused MSCs in LAD and infarction area; the comparisongroup infused with culture fluid. Turbo FLASH were performed after 3 and 6 weeks to study firstpass myocardial perfusion. Signal intensitytime curve were drawn for analyzing. Results： Hypoenhancement on firstpass and hyperenhancement on delayed phase appeared in patiens who didn′t receive thrombolysis therapy. There were significant differences between the time of upslope, the rate of upslope, peak time of the signal intensitytime curves and contrast enhancement ratio of ischemic myocardium and normal myocardium. The peak signal intensity of ischemic myocardium was (52.5±11.0)% of normal. Hyperenhancement appeared on firstpass and delayed phase in revascularized patients receiving thrombolysis therapy. Only the time of upslope prolonged. And the peak signal intensity of ischemic myocardium was (90.5±9.2)% of normal. Conclusion： Myocardial firstpass perfusion reflects the blood supply of the myocardium. To analyze the firstpass perfusion was helpful to assess blood supply of the damaged myocardium, and to evaluate the effect of thrombolysis therapy after transplanting MSCs. & q" `7 I# T6 p' m3 B! D. R% F. u& z8 J6 k
［Key words］MSCs;myocardial infarction;transplant;magnetic resonance imaging ( t. V/ i% a: D5 a " B) p/ h8 b& Q% _9 {3 } , n9 w8 D: K- v! t5 @# f: g5 b; ^+ G/ f: {( {7 ^/ V) c
20世纪70年代Friedenstein在骨髓培养中发现一类易于黏附于塑料培养板表面的呈纺锤状的基质细胞,证实其具有在体外培养容易贴壁生长、形成集落、分化成定向祖细胞、并能大量扩增的特点。随后进一步的研究发现该类细胞具有自我更新、分化增殖和多向分化潜能的特点,在一定的环境和刺激因子作用下可分化为间充质组织细胞,如肌原细胞(包括心肌细胞)、骨细胞、软骨细胞、神经细胞及脂肪细胞等［1］，遂将之命名为骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。在组织工程中, MSCs作为一种重要的种子细胞越来越引起人们的关注,是近年来国内外研究的热点。特别是干细胞移植更是目前冠心病治疗领域的新方向。本研究拟应用磁共振（MR）成像扫描，评价MSCs移植后缺血心肌再生及血运改变的情况。 6 R/ a* [1 T2 w. m: ]$ [; T; m1 C ' |' v3 t% s2 H: P 1材料和方法( }! J* j! b4 A, U
; E( l& y: I8 [$ q: w 1.1实验动物贵州香猪8只，雌雄不拘，体质量19～21 kg，由上海第二医科大学仁济医院动物中心提供，随机分成实验组和对照组，每组各4只。 " g% M( U, x- F! H6 o$ S / b, W3 z" j7 l2 ^# s 1.2自体MSCs抽取和培养生长良好的第一代MSCs用0.25 mg/L胰蛋白酶（Sigma公司、用1 mmol/L EDTANa2配制）消化，按1∶3的比例再次接种传代，当这些细胞生长接近融合层时，即得到骨髓间质干细胞。术日晨，以胰蛋白酶消化，细胞总数为2106，备细胞移植用。1.3心梗模型建立 动物麻醉后，股动脉置管测动脉压力，自左侧第4肋间进胸，打开心包，显露冠状动脉左前降支(left anterioi descending coronary artery，LAD），再紧靠第一对角支以远结扎LAD。0 u0 N: L+ u6 P2 x ?# R W J
) w! r f7 C; t) } 1.4MSCs移植实验组自结扎远端紧靠结扎处用0T针头将2 ml的细胞悬液（细胞数1106）注入LAD，在靠近心尖部、室间隔部、左室前侧壁缺血的心肌上将另外2 ml的细胞悬液注入到心肌内。对照组同法等量注入DMEM培养液(Gibco)。/ K2 }2 b5 H9 [# D) s
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1.5MR扫描技术分别在移植3周和6周后麻醉香猪进行MR扫描检查。采用1.5T超导MR成像仪(Siemens， German）。平扫后行GdDTPA增强扫描MR灌注成像。MR灌注成像采用T1WI turbo FLASH序列，TR 3 ms，TE 4 ms，TI 300 ms，翻转角度8，矩阵128128，视野350 mm，层厚10 mm，每3 s成像一次，5～10 min后做延迟扫描，GdDTPA剂量为0.1 mmol/kg，经静脉推注，速度2～3 ml/s。. x3 m, o' q( |$ A- s
5 w4 _8 {, N3 n; }& u( \: \ 1.6后处理及资料分析在MR灌注成像图像上，选取合适的ROI，取样面积0.1～0.2 cm2，测量左室及左室各壁（前壁、侧壁、后壁及室间隔）心肌，胸前壁皮下脂肪信号强度（signal intensity,SI），同层面各ROI位置与大小一致。对心肌SI用皮下脂肪信号进行标化，取标化的信号强度绘制信号强度-时间曲线（signal intensitytime curve, SIT），取左室增强前心肌SI均值为基值（SIbase），根据曲线计算曲线峰值时间（tmax）和峰值信号强度（SImax）、曲线上升时间（△T＝tmax-tmin）、曲线上升斜率［S＝（SImax-SImin）/△t］、对比增强率［SI％＝（SImax-SIbase）/SIbase］以及病变区与正常心肌峰值SI的比值（SIles/SIn） 0 n' W" n" `, v# `# H% z9 Z7 \; |0 k + Y' Z6 U" [/ |0 K( X( m+ y 1.7统计学处理所有数据均以±s表示，采用EXCEL和SPSS分析系统，对S,SI%,SImax作t检验。 5 l2 k4 Z/ W+ V" {. H# J" f: m/ r* D5 a$ e# ~5 p6 t
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2结果 + L0 y" R: C$ R1 g* O 8 u% G1 ` |$ C! ?3 g 2.1对照组病变心肌与正常心肌SI比较心肌灌注成像示注射造影剂后，SI-T曲线（图1）示正常心肌信号强度在（13.56±5.44）s内上升达峰值，然后缓慢下降。病变心肌曲线上升缓慢，峰值信号强度降低，仅为正常心肌的（52.5±11.0)%，达峰值后维持一平台水平。△T较正常心肌明显延长，SImax,S及SI%均明显低于正常心肌,差异具有统计学意义（表1）。 3 y( l; j+ u+ z* r5 Z4 U1 n5 v2 t5 u2 L$ G1 |4 H i
图1对照组猪心肌SIT曲线 略 ( h( D7 _6 a) ?) U4 G( y" E 7 S1 b" U; ?: K9 ^9 x/ H6 } 表1正常心肌与病变心肌SIT曲线参数比较 略+ x4 C; `: {- B3 P" z4 ?
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2.2MSCs移植组病变心肌与正常心肌SI比较移植后3周SIT曲线示病变心肌曲线上升，峰值信号强度增加，病变心肌仅△t增加，延迟扫描时心肌SI下降，但病变心肌SI略高于正常心肌（图2）。移植后6周SIT曲线上的SImax，△t,s及SI%均较接近于或略低于正常心肌。增强后期病变心肌SI与正常心肌几乎相同，SImax可达正常心肌的（90.5±9.2）％（图3）。移植后6周移植组SIT曲线参数与对照组比较差异均有统计学意义（表2）。' T7 C0 j* _) D$ P/ x/ J
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图2－图3 略 h' v& Z9 N9 p" k2 m9 f! a7 e9 ~0 B5 p2 a4 d& N5 r; G @! i
表2移植组与对照组心肌SIT曲线参数比较 略" t. E) a) b' N# u; i" O
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3讨论 ) t' e! J/ k+ Z' f' o; j, x' @$ g
骨髓基质细胞中含有大量多能干细胞，具有间质细胞的特性，能分化成多种细胞类型。骨髓基质细胞获取方便，体外扩增也比较容易，所以它是一种缺血心肌内细胞移植的优良供体［2］。随着干细胞治疗进入临床,通过无创的影像学检查手段来评价、监测供体细胞的导入、分化、与宿主受损心肌细胞的整合以及心功能的改善状况十分必要。现阶段用于观察移植疗效的影像学手段有单光子计算机断层显像(SPECT) 、超声心动图、放射性核素心肌显像、磁共振成像等［3,4］。国外研究中,心脏MR应用较广泛,主要用于指导干细胞的导入、追踪移植细胞。心脏MR能在活体心脏上对心肌内注射范围的大小和位置进行准确而无创的评价,因此可提供干细胞在体内分布状况的信息,同时还可以指导经心导管途径进行细胞移植［5］。利用MR技术，可以通过心肌的流入效应来反应心肌的血流供应，这无疑为评价梗死心肌的血流状态提供了一种无创性的检查方法。心肌干细胞移植成功后常伴随相应新生血管的形成，MR心肌灌注在一定程度上反应新生血管的情况，也是评价疗效的一项有用的指标。延迟增强信号反映了梗死的大小，其减少量与射血分数的改善之间存在正相关，因此MRI观察延迟增强信号的变化可以反映局部心肌组织的变化。研究心肌首过灌注最常用的有磁化准备梯度回波序列（Turbo FLASH）和平面回波序列（EPI）。这两种序列都有足够高的时间分辨率，可以揭示给药数秒内心肌SI的变化，从而反应造影剂的流入效应。 采用Turbo FLASH成像时，TR缩短至3.3 ms，TE为1.4 ms，TI为300 ms，单层一次采集时间仅为425 ms，可在1～2个心动周期内完成一次采集，并可有效“冻结”运动。注射造影剂GdDTPA可缩短T1效应，注射后右心室、左心室、左心室各壁心肌信号会迅速强化。心肌SIT曲线可反映血液中造影剂流入效应及局部心肌血流灌注情况。 本文对照组病变心肌表现为首过灌注不强化，而延迟相强化，曲线△t,tmax,S及SI％均明显低于正常心肌（P# t l4 G% f8 ^$ y% z; V
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