1 r; v! E8 a- {5 e, z - g' T) ^6 V X& F+ f 5 p+ {( V9 n" V' J
【摘要】 目的： 研究大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）植入大鼠脑内后，在脑微环境作用下的分化行为。方法： 梯度离心法分离、培养、纯化MSC，Hoechst33342标记后植入大鼠海马CA4区；1，2，4周后处死大鼠取脑，制作冷冻切片；观察Hoechst33342阳性细胞，免疫荧光法CY3显示神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、神经巢蛋白（nestin）、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)阳性表达细胞。结果： MSC植入后可见大量细胞存活，沿针道、注射区向周围散在分布，植入细胞有呈红色荧光的NSE，nestin，GFAP及NGF阳性表达细胞。结论： MSC植入动物脑内后能够存活，并分化为神经系统样细胞，表达功能产物NSE、nestin、GFAP及NGF。 ! b! h! c8 V$ M7 D8 J" A 【关键词】骨髓间充质干细胞； 诱导分化； 神经系统 & j0 L' L) Q, o8 X" x Rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow differentiate into neurocytelike cells after transplanted into rat brain 1 N) a( i8 T; ^ m0 |! K % y& \% q Z; X; n9 b) O CAI Ning1,OUYANG Qi2,WANG Cunzu1 ( X, R3 D0 f" p/ l$ P( N7 O+ e* L p, `
(1.Department of Neurosurgery, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001;2.School of Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China), O. B5 R9 Z' x) K- c
, J2 a5 t, Z- A0 x7 z( b ［Abstract］Objective: To study survivorship and differentiation of rat mesenchymal stem cells (MSC) derived from bone marrow after being transplanted into rat brain. Methods： Rat MSC was isolated and purified in vitro,labelled by Hoechst33342, stereotaxis imbed into CA4 of rat hippocampus. Killed rat and recipe brain after 1,2,4 weeks tomake frozen section andobserve Hoechst33342marked cells under fluorescence microscope. Cells express GFAP, NSE, nestin and nerve growth factor (NGF) were colorated by CY3 immumofluorescence method.Results： Primary cell and passage cell grew adherence with great reproductive activity. After migration, many living cells can be observed round pin hole, distributed irradiately;implanted cells with red fluorescence can be seen on GFAP, NSE, nestin and NGF antibody effected sections. Conclusion： Rat MSC survived in rat brain and differentiated into neurol cell type like cells, expressed GFAP, NSE, nestin and NGF. , l/ G5 m1 u' ]9 U- q+ m9 J2 O, |8 M. m# X, A0 I
［Key words］mesenchymal stem cells;differentiation;nervous system - o6 e# Q8 c; Q" Q3 A! J( t 9 P& `" l% R+ e5 A& S, s4 T & O7 s+ d ?3 M4 P( C6 e/ Q+ ]# q0 Z- ^: N' K9 T9 J
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是骨髓中不同于造血干细胞的一类细胞，具有独特的表型和生物学特性，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌原细胞等中胚层细胞。近来研究发现，MSC可以分化为神经元样细胞、胶质样细胞等［1］，植入体内后对脑和脊髓的损伤性疾病有治疗作用［2］，为MSC替代治疗神经系统疾病提供了实验基础。本实验梯度离心法分离培养、纯化MSC，Hoechst 33342标记后移植到大鼠海马内，观察其分化和迁移等生物学特性。0 M7 m' o/ H( O5 a! q5 h
3 A6 Z+ h# Q1 A7 R 1材料与方法 ) P N" e C1 B A + Q) }9 h6 e/ p4 }* Q6 H' y% q; C% b 1.1动物、试剂与器材SD大鼠，为扬州大学比较医学中心提供，共14只，2月龄，体质量230～250 g，雌雄不限。LDMEM:Gibcobrl公司，胎牛血清：Life Technologies公司。兔抗大鼠nestin,NSE,GFAP多抗抗体：Cy3标记山羊抗兔二抗：武汉博士德公司。兔抗大鼠NGF，Hoechst33342：Sigma公司。CO2培养箱：FormaScientific公司，TE300倒置显微镜：Nikon，实验动物脑立体定向仪：江湾Ⅰ型C，冷冻切片机：CM1900型LEICA公司，荧光显微镜：DM LB2型LEICA公司。 - \7 L M# t2 _- J! }5 R6 V# `' O; E; l
1.2方法4 ~* ~ d6 ~0 `) X
( b) x* w/ B1 H( z( c: M- E; ~ 1.2.1MSC的分离培养与传代与前期试验的方法相同［3］。0 V) w- @0 i l' T$ A
2 }" E- z/ V3 o7 p 1.2.2MSCs的体外标记与植入培养液中1∶200加入1 mg/ml Hoechst33342溶液，37℃,5%CO2温育10 min。LDMEM洗涤3次，消化离心制成细胞悬液。大鼠麻醉后固定于立体定位仪上，前囟为0点，海马CA4区坐标（前囟后-4.2 mm, 左侧2.5 mm,进针深度3 mm）［4］， 10 μl(106)的细胞悬液以1 μl/min速度注入。留针10 min后缝合切口，注射青霉素。共植入9只。 . Q) |: T5 F x9 F1 T- H1 z& M' j6 H s$ a5 u1 q! C6 p1 Q1 k
1.2.3制作冷冻切片观察Hoechst33342标记细胞移植后1,2,4周每次取3只大鼠麻醉后经左心室至主动脉根部插管，生理盐水及4℃4%低聚甲醛 (pH7.4)先快后慢灌流固定。取脑组织30%蔗糖溶液、4℃脱水。海马区脑组织做冷冻连续冠状切片，厚20 μm； 50%甘油封固，420 nm荧光激发下，观察核呈蓝色荧光的细胞。 ! q# K5 ?& j0 F# f9 j% r! v, I1 R , O& o; S2 P3 A4 a% m" c 1.2.4免疫荧光法显示GFAP,NSE,nestin和NGF的表达情况切片PBS清洗；加含0.3% Triton的5% BSA，37℃湿盒中1 h；分别加含0.3%Triton的1%BSA稀释兔抗大鼠GFAP(1∶100), Nestin(1∶100),NSE (1∶100),NGF (1∶100)一抗37℃湿盒3 h(或4℃过夜)，PBS洗涤，加Cy3标记山羊抗兔二抗(1∶200稀释) 37℃ 1 h，荧光显微镜下观察染色效果，2次PBS、1次双蒸水清洗，50%甘油封固；分别在420 nm和570 nm荧光显微镜观察Hoechst33342阳性细胞和GFAP阳性细胞。, J# B5 k7 e, g) l+ {: q
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2结果 : t1 G5 n2 m) u' L% d* k. x7 _) g( g
2.1荧光显微镜下观察植入区可见密集的核呈蓝色荧光的细胞，针道及植入区周围见蓝色荧光标记细胞逐渐减少，可分辨出单个的细胞核（图1），沿神经纤维纵轴呈链状平行分布。植入后1,2,4周均有MSC存活；第1周时存活细胞最多，每高倍视野（400）平均(162.30±47.27)个；第2周时存活细胞仍较多，平均(155.30±52.36)个；第4周时有所减少，平均(96.33±42.71) 个。& t8 l0 E1 X7 h' r
8 T9 Z0 g1 b% v ?6 A$ _ 2.2Hoechst33342标记细胞GFAP,NSE,nestin和NGF表达情况可以看到GFAP阳性细胞广泛存在，有特异性染色存在，即蓝色、红色荧光同时存在（图2,3）, 第1，2周时较少，到第4周时才有所增多。NSE特异性染色细胞也同时存在，但分布较少，第4周时才有所增多。nestin特异性染色细胞存在，以第1周时较多，第2周时就开始减少，第4周时明显减少。NGF特异性染色存在，1，2，4周变化不大。/ Q* w5 E8 o3 i' a& `6 F
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3讨论 9 y: U' o) ]2 M, ? }* N% p- H* s7 c9 G* k
3.1骨髓间充质干细胞及其生物学特性MSC发现较早，但未被重视，直到近年来随着细胞组织工程学和基因治疗的研究发展，干细胞的概念提出以后，才重新被认识和重视。MSC具有两个特点：① 离体培养时，细胞贴壁生长，寿命有限；② 在相应的培养条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经系统组成细胞等，称为MSC的可塑性(plasticity)［5］。其鉴定需通过诱导后定向分化进行，在前期实验里我们已进行了MSC体外诱导向神经系统细胞分化的研究，证明我们所分离的细胞是MSC［3］。 $ M; X) {4 J) G! T & j& Z& c# _# d! _- t+ q: { 3.2脑内微环境诱导MSC向神经细胞样细胞分化Kopen等［6］发现植入大鼠脑内的骨髓干细胞分化为胶质样细胞。 Priller等［7］2001年发现植入大鼠脑内的MSC分化成了新生的蒲肯野细胞。我们将Hoechst33342标记的MSC细胞植入大鼠脑内，利用NSE,GFAP,Nestin,NGF免疫荧光双标记观察脑内环境诱导MSC细胞向神经样细胞分化的情况。结果显示这些 MSC可被脑内环境诱导分化为神经元、星形胶质样细胞和神经前体样细胞。NSE主要在成熟神经元中表达，本实验结果显示在移植物周边部位有NSE细胞，形态呈神经元样，说明这些细胞已经在脑内分化为成熟的神经元细胞，但NSE特异性染色细胞较少，提示植入的细胞分化为神经元样细胞较少，可能与海马内为皮层下区，诱导MSC向神经元样细胞分化的因子较少有关；GFAP主要在星形胶质细胞中表达，实验结果示在移植物团块内及周边均有大量GFAP阳性细胞分布，呈现Hoechst33342和GFAP双荧光染色阳性，证明来源于植入的MSC，周边部也有GFAP单染色阳性细胞，为原有细胞的非特异性染色，证明植入的MSC分化为胶质样细胞。nestin特异性染色细胞存在但以第1周时较多，第2周时就开始减少，第4周时明显减少，可能是因为植入细胞存活的数量减少，也可能是植入的细胞开始分化时为神经前体细胞，随时间延长而后分化为胶质样细胞及神经元样细胞表达NSE,GFAP，而不再表达nestin从而导致nestin特异性染色细胞减少。NGF特异性染色存在说明植入的MSC分化时产生NGF，对其分化产生帮助。在大鼠海马内含有大量的神经营养因子,如NGF,BDNF,bFGF等，非常适合干细胞的生长。以往的研究发现［8］，这些因子在海马损伤后的第4～11天达到高峰，细胞的植入也是一种损伤，同样会引起神经营养活性增强有利于植入细胞的存活。 ^% q9 _# w+ x1 g& N- g J
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3.3与原有细胞整合的情况Englund等［9］发现MSC植入大鼠脑内后分化的细胞具有神经元形态和表面标志，与邻近神经元形成广泛连接，并观察到了新生神经元产生的动作电位。Wu等［10］应用电镜技术发现移植入脑内的MSC很好地整合到了宿主脑内,并生长出包绕神经纤维的突起。说明植入的干细胞能够分化成有正常功能的神经元，并可整合入原有神经投射。我们在实验中并没有明确看到植入的MSC与原有的细胞整合的证据，这是免疫组化和免疫荧光法看不到的，我们将在下一步的实验中用电子显微镜寻找细胞整合的证据。虽然已经得到MSC离体分化为神经元或胶质细胞样细胞的证据，但是还不能认为所分化的细胞就是神经元或胶质细胞，因为分化后细胞是否具有功能，是否和宿主神经元建立突触联系，是否有神经递质生成等，目前还不清楚，应该成为进一步研究的重点内容。（本文图1~3略）# v) ~0 `! D' r" j L/ p0 }7 @
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