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标题: 刺五加注射液对骨髓间充质干细胞增殖的影响青海大学医学院中青年科研基金项目 [打印本页]

作者: 文献管理员 时间: 2009-3-3 12:27 标题: 刺五加注射液对骨髓间充质干细胞增殖的影响青海大学医学院中青年科研基金项目

作者：王明宁  胡琳  马祁生  侯成荣杨生玺  张昱  王文青作者单位：（1.青海大学医学院；2.青海高原心脏病研究所） 3 \! D5 p7 {3 L, j5 u8 X6 ~

   # z, ~  O+ Y3 q+ t4 F

                     4 _  \( q# E1 A; L
         0 [' z. r, \4 E/ c5 g: Q7 Y- j4 p





      * i8 G" D3 X5 L# H8 e
      【摘要】  目的  探讨刺五加注射液对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)增殖的影响。方法  体外培养MSC,用四甲基偶氮唑法检测刺五加注射液促进大鼠MSC增殖的作用;用免疫组化法检测MSC细胞的Brdu标记阳性率。结果  4种浓度的药液对MSC的增殖作用与对照组比较有显著性差异（P
      【关键词】刺五加注射液  骨髓间充质干细胞  细胞增殖6 O/ E! v7 [9 a& O' w, y
   EFFECT OF ELEUTHEROSIDE INJECTION

ON PROLIFERATION OF BONE MARROW) D7 I  ]+ F  u
* |* i4 r$ ]' V8 {8 |0 {4 @, K
MESENCHYMAL STEM CELLS IN RATS  \6 {6 M4 w& y0 Y% S/ E
; f9 `) C! E/ p& Q' M1 M3 J, A
Wang Mingning1 ，Hu Lin2，Ma Qisheng1，Hou Chengrong1
4 q* n( O! w2 b% y/ M- T  A" n8 n
Yang Shengxi1，Zhang Yu1，Wang Wenqing1
& ?/ @- G9 f) b* c, L  o
（1. Qinghai University Medical College；2. Cardiovascular Institute ofQinghai）
" J4 l' R: w! a
AbstractObjectiveTo investigate the effect of eleutheroside injection on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Methods MSCs were isolated from rat bone and cultured under same conditions. The proliferation effect of eleutheroside injection on MSCs was detected with MTT and the Brdu marking positive rate of MSCs was detected with immunohistochemical method. Results There were significant difference among four kinds concentration of eleutheroside injection on MSC compared with control group (P

Key wordsEleutheroside injectionMesenchymal stem cellsCell proliferation5 X5 E4 k- n( b3 S( |

骨髓间充质干细胞( Mesenchymal stem cells,MSC)具有向多种细胞系统分化的潜能，自体获取的骨髓MSC回输后不会发生免疫排斥反应，体外基因转染率高，因此，骨髓MSC已成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点,但骨髓中MSC的含量非常少。我国中药资源丰富，在这些中药中可能有大量的能够促进干细胞增殖、分化的药物。刺五加注射液是临床常用中成药注射剂，能够平补肝肾、益精壮骨,用于肝肾不足所致的短暂性脑缺血发作、脑动脉硬化、脑血栓形成、脑栓塞等症。本研究组通过体外实验研究了刺五加注射液对骨髓间充质干细胞增殖的影响，现报告如下：
) u# C2 m- L1 A, [# V, D# e) v! Y
1材料与方法

1.1材料8 W- b' Z6 O$ V

淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），L-DMEM（细胞培养液）、小牛血清（Gibcobrl公司），胰蛋白酶（Sigma USA），5 - 溴尿嘧啶核苷(Sigma公司) ，四甲基偶氮唑盐（Sigma公司），二甲基亚砜（Sigma公司），刺五加注射液（黑龙江完达山药业，总黄酮，5mg/ml,批号: 200411231），SD大鼠（青海地方病研究所实验中心）

1.2方法4 u/ K* R8 Q2 |
4 J9 c% R; |: A5 W1 _
1.2.1大鼠骨髓MSC的分离与培养：取体重200 g SD大鼠的股骨和胫骨，用DMEM冲出骨中骨髓，将冲出的混合液离心(1. 5 103r·min- 1 )10 min, 去上清液后，用DMEM制成细胞悬液，用吸管沿管壁慢慢将细胞悬液加入已装有4 ml分离液的离心管中，使两种溶液间有明显的界面，水平离心(1.9 103r·min- 1 ) 20 min，用吸管小心吸取中层白色雾状的淋巴细胞层，并用DMEM洗涤2次，最后用含15%小牛血清的DMEM培养液重悬，接种（5107个/ml），置孵箱（37℃，5%CO2）培养，第3天换液，此后每周换液两次。& j# K5 g" k$ c3 G
$ h: s8 j4 g) `
1.2.2加药培养：细胞接近融合时，按1104/ml传代，传至第五代时，将细胞浓度调整为2105/ml，接种到96孔板（100μl/孔）培养24 h后，将上清液吸去，加不含血清的DMEM溶液（100μl/孔），培养24h后，吸去上清液，每孔加100 μl含15%胎牛血清的DMEM培养液，同时加入刺五加注射液（刺五加总黄酮分别为5、1、0.5、0.33、0.25 mg /ml），每个浓度设3个重复孔， 3个阴性对照孔加等量的生理盐水，分别培养24、48 h，用MTT法检测刺五加注射液和生理盐水对细胞的增殖作用。! `1 Z& d9 l/ Z
, a5 [1 L1 D! U- G4 q
1.2.3四甲基偶氮唑盐（MTT）的监测：培养24、48 h后，吸去培养液，加MTT溶液（5mg/ml，20 μl/孔）孵育4 h，吸出MTT，加入二甲基亚枫（200 μl/孔），在酶联检测仪490 nm处测试吸光光度值,结果见表1。. \# V, N! s$ O# Z) z8 y

1.2.4细胞爬片的制备：将细胞浓度调整为2105/ml，接种于预先放有涂有多聚赖氨酸玻片的24孔板（1ml/孔），培养24 h后，将上清液吸去，加不含血清的DMEM溶液（1ml/孔），继续培养24 h后，吸去上清液，每孔加0.59 ml含15%小牛血清的DMEM培养液及5 - 溴尿嘧啶核苷（Brdu），同时加入刺五加注射液（浓度梯度为：原液，5倍、10倍、15倍、20倍稀释液）0.41 ml/孔，对照组加生理盐水（0.41ml/孔），一个浓度设3个重复孔，使每孔Brdu的终浓度为10 μg/ml。
1 c& U; E6 l# c# t) `1 X; C
1.2.5Brdu的检测：培养48 h后，吸去培养液，用 Carnoy液固定细胞10 h，自然干燥。3%H2O2、室温条件下孵育5～10 min(以消除内源性过氧化物酶的活性)。蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5min。5%～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，滴加适当稀释的Brdu抗体（1：200），37℃孵育2 h, PBS冲洗(5min3times)。滴加生物素化山羊抗大鼠IgG， 37℃孵育20 min。PBS冲洗（5 min3times）。DAB显色5 min，封片。每张切片镜下随机选取10个视野计数阳性细胞数，取平均值，结果见表2。表1刺五加注射液对MSCs增殖的影响注：实验组与对照组的比较： *P

1.3统计学分析: O- [/ O6 u- i1 v! T- m0 C

本实验所有计量资料以均数±标准差表示，显著性检验采用方差分析，组间比较采用几个处理组均数与一个对照组均数比较的Dunnett法。& M% M2 l( A/ ~3 h

2结果; j, ]) i% J( v" ^& X& e  M3 w
! U. g9 M: y! ?+ x
2.1MTT法监测刺五加注射液对MSCs增殖的影响：表1显示，刺五加组的吸光度与生理盐水组比较有显著性差异。24 h OD值：实验2至5组分别与对照组比较，P值均小于0. 05，而实验1组与对照组比较，P>0. 05 ；48 h OD值：实验2至5组分别与对照组比较，P值均小于0.01，而实验1组与对照组比较，P>0. 05；而且不同药物浓度组间的吸光度也存在一定差异,实验1、5组24 hOD值比较，P 5 J0 x+ r; W- j# P

2.2刺五加注射液对MSC Brdu标记阳性细胞数的影响+ C2 z  U5 T7 v8 l( {2 ]# W1 a2 `

表2显示，刺五加组的阳性细胞数与生理盐水组阳性细胞数比较有显著性差异，实验2至5组分别与对照组比较，P值均小于0. 05，而实验1组与对照组比较，P>0. 05。表2刺五加注射液对MSC Brdu标记阳性细胞数的影响注：实验组与对照组的比较： ﹡P
  Y1 T4 S2 M! N! Z9 r
3讨论

干细胞治疗是通过动员或移植自体、异体干细胞进入宿主体内,以补充、替代或纠正某些组织细胞数量或质量异常的细胞,造血干细胞移植治疗白血病和其他恶性肿瘤已取得了良好疗效［1］。刺五加注射液为五加科植物刺五加的茎叶经水醇法提取精制而成的棕红色灭菌溶液,为榛皮酊、丁香苷和金丝苷等皂苷、多糖和黄酮的混合物［2］。刺五加皂甙(ASS) 能提高神经元存活率、降低LDH 释放量及NO 含量［1］。刺五加尚含有超氧化物歧化酶,具有抗氧化作用［3］。刺五加可增加冠状动脉回流量、减少心肌氧量,清除自由基对组织的损害等作用［4，5］。本研究用5个不同浓度的刺五加注射液培养大鼠骨髓间充质干细胞，作用24 h、48 h后通过MTT法观察，显示其中4个浓度的药液对MSC具均有增殖效应，且作用48 h后4个浓度的药液对MSC的增殖作用更为显著；应用Brdu标记MSC后同样也观察到其中4个浓度的药液组的MSC的阳性细胞数与生理盐水组阳性细胞数比较有显著性差异，说明刺五加注射液对MSC的增殖具有一定的促进作用。刺五加注射液促进MSC增殖的作用原理可能和其抗氧化作用有关，具体作用机制还需进一步确认。
      【参考文献】
［1］胡煜，陈维信，阎影.骨髓间充质干细胞在现代细胞治疗中的潜在作用［J］.国际移植与血液净化杂志，2006,4（3）：35-375
& T% u8 q5 t% [. p% }! u8 u+ h; t

［2］杜秀芳,刘伟娜,詹文红.刺五加注射液的临床应用进展［J］.现代中西医结合杂志，2007,16（24）:3602-3603
: o1 Q: L" d5 b' E

［3］睢大员,曲绍春,于小风,等. 刺五加叶皂甙对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］ . 中国中药杂志,2004, 29(1)：71-741 q6 _. u+ I0 b' Y1 a

0 A& s3 W" S+ Y& T6 p' g- ^
: j2 F* L; d& f1 ~
［4］陈应柱,顾永健,吴小梅. 刺五加皂甙对缺血性脑损伤的保护作用［J］. 中国急救医学,2004 , 24(8)：583-584
" K4 S; s; O. U8 v

. j4 C# e' |. V: ?# a
［5］黄作义,吴军,张海鸥,等. 刺五加对大鼠迟发性脑血管痉挛CGRP，MRNA 表达变化的影响［J］ . 中国老年学杂志,2004, 24(5)：442-442

作者: txxxtyq 时间: 2015-6-23 07:08

哈哈,这么多的人都回了,我敢不回吗?赶快回一个,很好的,我喜欢

作者: 陈晴 时间: 2015-6-25 20:54

我顶啊。接着顶

作者: nauticus 时间: 2015-7-7 12:18

间充质干细胞

作者: bluesuns 时间: 2015-7-31 20:35

加油站加油

作者: sky蓝 时间: 2015-9-12 17:24

谢谢楼主啊！

作者: tuanzi 时间: 2015-9-28 07:11

拿把椅子看表演

作者: 橙味绿茶 时间: 2015-10-6 10:43

回答了那么多，没有加分了，郁闷。。

作者: 科研人 时间: 2015-10-11 12:36

呵呵，等着就等着....

作者: 依旧随遇而安 时间: 2015-10-20 19:59

我的啦嘿嘿

作者: foxok 时间: 2015-10-29 14:18

不是吧

作者: 罗马星空 时间: 2015-10-30 13:18

一个子没看懂

作者: marysyq 时间: 2015-11-13 14:35

应该加分

作者: 龙水生 时间: 2015-11-22 15:34

是楼主原创吗

作者: 我心飞翔 时间: 2015-12-17 16:00

拿把椅子看表演

作者: 龙水生 时间: 2015-12-18 20:22

感觉好像在哪里看过了，汗~

作者: awen 时间: 2015-12-20 16:18

宁愿选择放弃，不要放弃选择。

作者: laoli1999 时间: 2016-1-12 12:16

原来这样也可以

作者: www1202000 时间: 2016-2-21 11:26

羊水干细胞

作者: 化药所 时间: 2016-2-27 19:01

其实回帖算是一种没德德，所以我快成圣人了

作者: frogsays 时间: 2016-3-16 14:36

做一个,做好了,请看

作者: 修复者 时间: 2016-4-13 17:50

家财万贯还得回很多贴哦

作者: dada 时间: 2016-4-14 11:43

谁能送我几分啊

作者: 温暖暖 时间: 2016-4-26 00:01

谢谢干细胞之家提供资料

作者: xm19 时间: 2016-4-30 12:54

呵呵,支持一下哈

作者: 追风 时间: 2016-5-19 21:01

呵呵那就好好玩吧~~~~

作者: heart10 时间: 2016-5-24 19:02

我顶啊。接着顶

作者: 糊涂小蜗牛 时间: 2016-5-30 23:41

顶．支持，路过．．．．．

作者: 一个平凡人 时间: 2016-6-20 15:01

不错!

作者: 加菲猫 时间: 2016-6-23 16:52

顶你一下，好贴要顶！

作者: foxok 时间: 2016-7-3 14:01

帮顶

作者: dongmei 时间: 2016-7-21 13:54

每天都会来干细胞之家看看

作者: tempo 时间: 2016-7-30 09:43

今天临床的资料更新很多呀

作者: Greatjob 时间: 2016-8-3 07:01

家财万贯还得回很多贴哦

作者: 分子工程师 时间: 2016-8-6 14:10

楼主good

作者: mk990 时间: 2016-9-2 14:54

一个有信念者所开发出的力量，大于99个只有兴趣者。

作者: 陈晴 时间: 2016-9-4 10:44

真是有你的！

作者: foxok 时间: 2016-9-18 11:27

干细胞研究还要面向临床

作者: 983abc 时间: 2016-9-26 02:43

@,@..是什么意思呀？

作者: dglove 时间: 2016-9-26 11:27

拿分走人呵呵，楼下继续！

作者: lab2010 时间: 2016-9-28 16:18

天啊. 很好的资源

作者: 榴榴莲 时间: 2016-10-8 00:01

朕要休息了..............

作者: aliyun 时间: 2016-10-17 22:17

干细胞治疗糖尿病

作者: 碧湖冷月 时间: 2016-10-21 12:26

不要等到人人都说你丑时才发现自己真的丑。

作者: 水木清华 时间: 2016-11-2 10:08

我想要`~

作者: lab2010 时间: 2016-12-26 04:41

支持你一下下。。

作者: happyboy 时间: 2016-12-28 16:54

慢慢来，呵呵

作者: ladybird 时间: 2017-1-4 18:59

(*^__^*) 嘻嘻……

作者: 王者之道 时间: 2017-1-25 16:21

谢谢分享了!

作者: bluesuns 时间: 2017-3-2 11:18

这样的贴子，不顶说不过去啊

作者: 修复者 时间: 2017-3-8 07:28

我帮你喝喝

作者: 舒思 时间: 2017-3-23 17:43

慢慢来，呵呵

作者: whyboy 时间: 2017-4-2 01:43

干细胞与基因技术

作者: 天蓝色 时间: 2017-4-19 07:06

回复一下

作者: yunshu 时间: 2017-4-22 00:48

干细胞存储

作者: dreamenjoyer 时间: 2017-5-25 20:42

想都不想，就支持一下

作者: pengzy 时间: 2017-5-27 16:16

好困啊

作者: 心仪 时间: 2017-5-28 23:07

(*^__^*) 嘻嘻……

作者: 分子工程师 时间: 2017-5-29 21:22

严重支持！

作者: 未必温暖 时间: 2017-6-16 00:33

不错，看看。

作者: apple0 时间: 2017-6-17 14:02

我毫不犹豫地把楼主的这个帖子收藏了

作者: 水木清华 时间: 2017-6-27 08:35

支持一下吧

作者: 石头111 时间: 2017-7-23 03:05

终于看完了~~~

作者: xm19 时间: 2017-7-25 00:28

问渠哪得清如许，为有源头活水来。

作者: ines 时间: 2017-7-26 17:30

这贴子你会收藏吗

作者: pspvp 时间: 2017-7-28 12:43

怎么就没人拜我为偶像那?? ~

作者: 甘泉 时间: 2017-7-29 02:49

我想要`~

作者: 陈晴 时间: 2017-7-29 21:54

风物长宜放眼量

作者: 蚂蚁 时间: 2017-8-15 20:22

干细胞产业是朝阳产业

作者: doc2005 时间: 2017-8-20 13:27

呵呵都没人想我~~

作者: yunshu 时间: 2017-8-23 17:43

好帖，有才

作者: xiao2014 时间: 2017-9-8 16:26

你还想说什么啊....

作者: 红旗 时间: 2017-9-12 13:27

不看白不看，看也不白看

作者: 罗马星空 时间: 2017-9-12 15:26

好好帖很好帖确实好帖少见的好帖

作者: tian2006 时间: 2017-9-30 01:48

说嘛1~~~想说什么就说什么嘛~~

作者: 老农爱科学 时间: 2017-10-7 05:56

这贴？不回都不行啊

作者: bioprotein 时间: 2017-10-9 07:25

支持~~顶顶~~~

作者: 蝶澈 时间: 2017-11-15 10:18

造血干细胞

作者: 再来一天 时间: 2017-12-13 03:40

这贴？不回都不行啊

作者: 狂奔的蜗牛 时间: 2018-1-18 03:04

楼主，支持！

作者: 坛中酒 时间: 2018-1-20 02:07

干细胞之家我永远支持

作者: abc987 时间: 2018-1-26 11:10

初来乍到，请多多关照。。。嘿嘿，回个贴表明我来过。

作者: nauticus 时间: 2018-1-28 12:10

楼主good

作者: popobird 时间: 2018-1-30 22:15

发贴看看自己积分

作者: 兔兔 时间: 2018-1-31 03:43

好贴坏贴，一眼就看出去

作者: 化药所 时间: 2018-3-14 21:43

好帖子，要顶！

作者: wq90 时间: 2018-3-15 00:35

真是汗啊我的家财好少啊加油

作者: 苹果天堂 时间: 2018-3-15 21:13

小生对楼主之仰慕如滔滔江水连绵不绝,海枯石烂,天崩地裂,永不变心.

作者: tuting 时间: 2018-3-24 11:27

顶下再看

作者: dypnr 时间: 2018-4-12 04:04

给我一个女人，我可以创造一个民族；给我一瓶酒，我可以带领他们征服全世界。。。。。。。。。

作者: 加菲猫 时间: 2018-5-5 18:46

好好帖很好帖确实好帖少见的好帖

作者: 水木清华 时间: 2018-5-17 12:27

我来了~~~~~~~~~ 闪人~~~~~~~~~~~~~~~~

作者: xiaomage 时间: 2018-5-20 23:00

我喜欢这个贴子

作者: biodj 时间: 2018-6-6 03:24

世界上那些最容易的事情中，拖延时间最不费力。

作者: 修复者 时间: 2018-6-8 03:18

表观遗传学

作者: tuanzi 时间: 2018-6-20 01:11

厉害！强~~~~没的说了！

作者: pspvp 时间: 2018-6-25 14:10

勤奋真能造就财富吗？

作者: tuting 时间: 2018-7-10 20:44

经过你的指点我还是没找到在哪 ~~~

作者: 水木清华 时间: 2018-7-25 17:35

加油啊！！！！顶哦!!!!!支持楼主，支持你~

作者: 三好学生 时间: 2018-8-5 19:56

抢座位来了

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