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标题: 养了一个月的hUC-MSCs 大家看看状态 密度咋样 [打印本页]

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作者: philexchang    时间: 2010-11-7 15:55     标题: 养了一个月的hUC-MSCs 大家看看状态 密度咋样

10X10的：
$ a* I$ M' ]$ D& e4 A9 p[attach]16380[/attach]
5 A: n9 m7 L) }: z2 g8 I0 {. }
5 b  L, s  Y; j; H6 U10X20的：4 _- l. \/ {" e4 e0 r
[attach]16382[/attach]/ |) u+ J( B6 w: Z4 H2 S* j
$ e6 Z& \. K" D1 l8 d
P8，从第五代接手养的，传了3次了。大家给看看 这个状态 密度怎么样？* Q7 G! s6 k  c8 `* Y0 U8 m
1、适合传代么？; k2 Q" H; n% Y4 T( x8 \' ~
2、传代消化时胰酶用多少浓度的？多长时间？5 o' ?( z; {3 b
3、离心机转速多少？时间多少？
2 `) x. w& s; C- w( |0 t! P, I4、感觉细胞个头比其他的要大许多，没做过原代，不知道它最初时是不是比现在的个头儿要小一些，战友们 多发表下意见吧~谢谢

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作者: sun_happone    时间: 2010-11-7 16:30

呵呵,第一次看到这种细胞~~~

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作者: 皮搋子    时间: 2010-11-8 00:06

状态还行，赶紧传代吧，要不就老了。离心速度1000-1500转，时间为5分钟。

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作者: philexchang    时间: 2010-11-8 09:49

回复 3# 皮搋子 / P( L3 x- G2 r

2 y& u: o1 h, I7 r' T, Y3 n' u0 v, T
    谢谢$ d! f4 z; A0 D! f7 I
消化的胰酶浓度多少？消化时间是？

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作者: illidancui    时间: 2010-11-8 11:52

有点宽扁，是不是有点老化呢？我的bmsc也有点这样。

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作者: 267318024    时间: 2010-11-8 12:31

第五代，按理说已经过了最佳的培养时间了，细胞状态不好，密度也差了点，没办法，传代吧，胰酶买的时候有配好的，浓度0.25%。
) y; k7 o6 p. l- A' E* ~: ~离心的话，转速时间同意楼上的！！

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作者: 267318024    时间: 2010-11-8 12:33

对了 ，胰酶量好像0.5~1ml吧，时间一般是3分钟，但是需要观察，细胞开始变圆后，就要用两倍于胰酶的体积的培养基冲洗了。

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作者: suxiaomei    时间: 2010-11-8 16:53

建议离心速度1000rpm 最好根据经验换算成g

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作者: philexchang    时间: 2010-11-9 11:48

回复 8# suxiaomei
. j# a- a  T/ H/ L1 s% x1 K
7 G3 a7 B, y# i) j
' x- u2 N: H+ \    多谢~

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作者: philexchang    时间: 2010-11-9 11:48

回复 7# 267318024
3 ]; t% A# c6 g# T. A7 r0 \9 [
* R% H% B! O: I# h' `: C& V8 U& W/ C4 h- x; |/ ^
    多谢

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作者: philexchang    时间: 2010-11-9 11:49

回复 5# illidancui 2 }! d) x' u/ M1 Y, W( G

* Q% o1 y. V- E# g$ W
9 o4 s% i  u4 J, u. _& L    我发现这东西越养越大，越扁 不知你是否有同感

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作者: dengyuan9    时间: 2010-11-9 16:35

可以传代了，但建议最多按1:3传；原代的个头肯定小一些，而且偏梭形，胰酶我一般是60平方厘米的培养皿加2毫升左右，置培养箱内消化大概3-5分钟，这个细胞不容易消化；离心式700——1000转每分钟都可以，时间4—5分钟。

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作者: philexchang    时间: 2010-11-9 22:29

回复 12# dengyuan9 % a6 _* s: C4 Q- W5 P* R3 g

( i8 @+ k) A6 z  t+ u
4 Q3 u  n$ E6 ]. `3 m" ^7 l, J0 o% ?谢谢！# S3 A( s/ V- z
每次传代后，发现漂了不少像细胞碎片一样的东西，而且直观的看起来，贴壁的细胞数量要比理论上少，怀疑漂的亮点就是传代过程中死亡的细胞碎片，您遇到过类似情况么？请问如何处理的？

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作者: dengyuan9    时间: 2010-11-9 23:03

回复 13# philexchang " ?; x+ J7 z8 P9 C# a
& Q, p! h8 V8 _. c  O' C

0 q1 f6 n2 [9 d$ R4 \    飘起来的亮的小球，是死细胞，我也常遇到，不过不是很多，除非是冻存又复苏的细胞，死的会更多，很多亮点的；0 h% ?' Y* _/ [& B0 I
   所以在胰酶消化的时候就需要把握好时间，尽量快一点，不超过5分钟。直径是8.75cm的培养皿，我最多加2ml的胰酶，浓度是0.25%（就是Gibco的，没有稀释过），加完立刻放到培养箱里消化，这样会快一点，大概2-3分钟就看到有大部分细胞飘起来了，不用等到全部飘起来，剩下的稍微吹打就起来了。

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作者: philexchang    时间: 2010-11-10 23:00

回复 14# dengyuan9 5 |2 ]6 ]) F! o9 ]: D

4 w7 z* U; ~; i* A6 ~+ c6 J( G4 a7 W) }: Q
学习了！
) f! k2 j; ]' _7 U% D- f关于细胞代数问题，用于注射治疗的细胞，代数应该控制在多少比较可取呢？

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作者: dengyuan9    时间: 2010-11-10 23:40

回复 15# philexchang
/ r% u) n) j1 d" u+ i  _; e# G) X* K5 U

3 N7 M: r& m; k' h/ `5 h3 M    注射用细胞我就不知道了，但肯定是代数越早越好，我在体内试验时，犬BMSCs细胞，第2或3代做体内，以后细胞体积变大，且出现分化，就不好用了

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作者: ljj0558    时间: 2010-11-11 09:06

注射用细胞，UCMSC一般在前四代可以，在往后理论上可以，7 e- j- Q# H  l5 e
我传到14代时细胞也是这个样子的。

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作者: jhu132llh    时间: 2010-11-11 10:46

1.5代的细胞长这样也不容易，这样的密度必须要传了，不然密度太高影响细胞活性。
4 J7 @) l" A0 D) b2.胰酶用0.25%，2-5分钟，你在37度消化2分钟的时候拿出来看看，一旦发现细胞变圆了立即用2倍体积的含血清的培养液终止消化。% i' y! N! F% x6 `  _4 p5 Z! d2 N6 O
3.离心机用低速的平甩离心机1000-2000rpm，5分钟，就行。  T0 ~9 E1 r8 H+ g
4.对于细胞的大小而言，是无所谓的。没事。

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作者: philexchang    时间: 2010-11-11 11:26

回复 18# jhu132llh 7 j! ]% v1 X) j  t! S6 O. y

3 l1 Z7 g8 H# O0 [; J+ z2 w5 p& b/ o  H2 @4 L
好 多谢~

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作者: philexchang    时间: 2010-11-11 11:27

回复 16# dengyuan9 " g8 Y# @' M+ I' P: b' _
% O) \" D3 c* u: ~1 c0 v
% f! H* \% j1 o: Q6 f* J" q
    多谢分享~

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作者: cherrydeng2006    时间: 2010-11-11 13:38


3 K3 f( u" g5 @

对了 ，胰酶量好像0.5~1ml吧，时间一般是3分钟，但是需要观察，细胞开始变圆后，就要用两倍于胰酶的体积的培 ...1 I0 O) A& n- x! N; ^0 r4 m6 o
267318024 发表于 2010-11-8 12:33

* C# M. W6 ]3 c  z' \

/ ]( ]. u  ^7 K6 F/ U5 x2 i, N, K; J8 I5 m& ]2 P, c
    这个时间可能长了，我们一般是1分钟以内。$ K) O. w; l) k) d6 q$ d
; E( d' `, v9 `& C" q" j
干细胞的特点就是：对胰酶的敏感度高，所以胰酶应该选择浓度为0.25%，添加适当浓度的EDTA。并且pH值也要保持在7.4-7.8，过高或过低的pH也会影响到消化的效果。添加量应该是在0.5ml/T25,1.5ml/T75，如果细胞对胰酶很敏感，可以减少一半左右。

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作者: hanbing    时间: 2010-11-13 18:10

细胞状态不是很好，我和你遇到的情况一样，细胞代次稍高就老化，感觉很脏！基本上也最多也就传到20代！留个联系方式可以？方便以后交流

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作者: cc1986    时间: 2010-11-13 23:38


2 B) E) b) p! F1 e6 Q1 g8 P$ R5 b' r4 o$ B; K& m0 H( P( v& g1 Q. t* t
楼上讨论很热烈，学习了很多，顺便贴下实验指导里面的图片，加深下印象~~图片是10倍物镜下8 ]) v, J% x& ?9 S8 U8 n$ B0 [$ v9 {* b: o
[attach]16813[/attach]# B/ l( R0 O, ]; j
A：40%融合，传代还早
$ F7 {" O' K' |/ W/ `& dB：80%融合，最佳传代时间
* T  ]: d- s# f9 |4 Z1 {) SC：接近100%融合，长太满，细胞会老化，活性下降。

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作者: philexchang    时间: 2010-11-14 14:50

回复 23# cc1986 ' ^; w; b4 w$ b; y0 H$ v

0 @; |9 O( }; T6 c
* G% N% \& \* L3 x- S    学习了！

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作者: weiyin    时间: 2010-11-15 11:08

不错。学习了

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作者: 布谷2010    时间: 2010-11-15 13:39

回复 23# cc1986 . Q4 P7 V( g2 o6 E& F' |# i2 w

' a, m) E7 T. b" ]7 S0 V- Y: X; P, K% ~  ?6 B5 ]" \
    请问这是什么书上的啊

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作者: flyingpnmc    时间: 2010-11-17 20:29

状态不好，建议重分。

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作者: 流云阿凯    时间: 2010-11-18 10:45

你的细胞有加BFGF吗？细胞的样子看着不错

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作者: ayeqiu    时间: 2010-11-18 14:17

个人觉得应该能传代了，就是感觉细胞比较脏。1 _( r( [1 b  y
消化用的胰酶浓度0.25%合适，时间视情况而定，看到有细胞脱落下来立即加培养基终止胰酶消化。
8 h$ j# ^) t: ^8 R6 T+ \4 p9 k+ ?+ ~7 P0 I我们常用离心为1000rmp/min，5min。效果挺不错的。

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作者: biohacker    时间: 2010-11-18 17:38

MSC长到70-80%就要传代了，长满时就分化了8 Z* B' G' |4 V% @5 X+ C
, V* l" Y$ X- k# f
你的细胞这种状态该传代了  f! E" U8 `. F( t
5 X2 j4 M: h$ w, Z# h( ^: Y( Y
胰酶浓度在0.05%，消化时间在2-3分钟，温度是37度: D7 t  j) [. C3 J5 }2 W5 {3 P* T& `
" R, N, d- S. v0 M/ m
离心1200rpm，时间10分钟
/ C  @" X( D+ N1 E: h( J3 ^; _) ]6 u
& H0 ^2 \0 Q  A/ V) ~6 x现在的细胞有点自分化了，MSC对血清要求很严

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作者: why121    时间: 2010-11-20 22:09

能否告知下你的元代接种密度及个数 培养周期等

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作者: mikeli    时间: 2010-11-21 11:40

根据我的经验，细胞状态不是太好，密度也有点过了，有老化的迹象

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作者: philexchang    时间: 2010-11-21 23:05

回复 31# why121 4 X' j) o7 Y; q3 E/ K9 E
! K8 ?0 X9 O4 n2 t3 V# u) ~% e
- v' \# f% p" g  b
    我是找公司要的~大概5天传一代~

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作者: philexchang    时间: 2010-11-21 23:05

回复 32# mikeli
4 T9 r/ r  ~, ?9 |# w2 n% ~# S0 o
: J/ U# V; z: l$ Q1 }, [2 l
, C' n6 [* H1 L$ Q3 W9 w$ b    恩 我后来综合大家的意见 也是得出这样的结论
# L- z' |( k% X5 c5 }学习了！

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作者: philexchang    时间: 2010-11-21 23:06

回复 27# flyingpnmc / [  M6 ~7 V4 D, v3 P, U

' B4 R* [  z- ?+ F$ G, S7 \& _  k  l
    恩 现在老化有些严重了 准备重新取细胞

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作者: philexchang    时间: 2010-11-21 23:07

回复 30# biohacker & @* d& W+ ?. K6 I! @

% K8 [, `1 O: f, ~8 s1 Q1 n, @' a+ x7 B5 n1 r6 H% [
    你提到的很有道理 我自己也发现细胞形态变得跟最开始拿到时不一样了 毕竟第一次养 这次学习了！

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作者: sijicc    时间: 2010-11-22 21:07

胰酶消化时间
- O9 \6 j2 J3 b: ~) c7 h6 D+ u
  y! G: G+ F) ^防止分化，应该使用低糖dmem, O8 M+ Z7 W1 T2 K5 Y

, u: ~9 w' {( S: ^血清浓度别太高，原代可以略高

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作者: dan    时间: 2010-12-2 18:46

我的细胞传代7、8代时基本也这样。感觉像长老年斑似的，要是老了的细胞能再年轻回来就好了，不知道各位高手有没有好的办法。传代我后来发现800转5分钟，消化不超过5分钟，细胞传代效果比较好。

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作者: cheese    时间: 2010-12-3 08:56

学习了

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作者: zhenhuale    时间: 2010-12-9 17:07

楼主的细胞有点老化，这个密度传代刚好，传代的时候要比平常密度大一点（细胞已老化），速度300g,10min，消化：0.25%胰酶，3min

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作者: 清影    时间: 2010-12-10 14:10

细胞长过了（融合80%就可以传代了），离心转速1200 5min就可以了

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作者: liujucool    时间: 2010-12-10 18:59

P5细胞感觉状态不好 ，赶紧传代吧，个头比BMSC大点

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作者: deron    时间: 2010-12-11 11:55

细胞边缘模糊，整体扁平拉长，核质比极低，已经属于老化比较严重了，不知楼主打算用来做什么实验

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作者: vae有何不可    时间: 2010-12-11 13:18

胰酶的浓度一般用0.25%，消化时间不得超过3分钟，否则对细胞有杀伤作用。转速1000rpm左右吧。不宜太高，同意楼上的。

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作者: chuanbaozang    时间: 2010-12-13 09:00

有点老化了，有些实验不适合去做了' V8 J6 \6 O! j# J, A6 i1 X/ B) q0 q
不过传代看看吧

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作者: 157238360jwj    时间: 2010-12-24 23:58

回复 philexchang 的帖子+ g* N6 A: D% x* g, i* I

1 k: `% H6 d2 U! z) r! K# j+ W4 I1， 应该传代了，细胞状态不是很好，第一，密度不够，第二，细胞漩涡形态不明显，且胞质间的颗粒较多，排列不整齐，有些细胞已完全铺开，处于老头状态，第三，细胞是否太不干净了，传代时尽量多洗几遍。& V& H( v# Z6 A" ^5 i/ m! y
2.  0.25%浓度的胰酶即可，时间嘛，显微镜下观察，有细胞皱缩变圆即可，再用指尖轻轻敲打几下，加培养液（2倍胰酶量）终止消化，# Q' x2 u' y0 K: a; @
3.  离心的话，1200r,5min即可

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作者: ljzmy82    时间: 2010-12-26 09:33

状态不好

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作者: 马锡慧    时间: 2010-12-27 22:14

细胞的状态不好，可以传代试试能不能挽救

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作者: 清影    时间: 2010-12-28 08:44

回复 philexchang 的帖子
- g6 ]8 r: o) z% z& [3 m8 n! `% Y( F1 @! x5 I" N: A, V
感觉传代的话有点过了。细胞形态也不是很好，流式检测情况怎么样？要是传代消化的话用胰酶0.25%37度消化约2-3分钟（时间不等，看贴壁情况，细胞变圆时即可）。离心1100rpm，5-6min.

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作者: 湘山山    时间: 2010-12-28 22:43

回复 清影 的帖子
/ }, e9 @* r# l+ {- E! @
" Y/ @9 ]; E4 Y8 \7 m$ }( f, Q. P& }很多老化了，估计不能用了。

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作者: ssh    时间: 2010-12-29 09:40

离心1000转 5分钟0 Z) ~* [6 W' M
胰酶买配好的 浓度一般都是0.25  消化时间不易过长 一般1、2分钟吧  
" I( X+ {' F  I: l你这个细胞已经有些老化了  密度还好  

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作者: philexchang    时间: 2010-12-30 16:38

回复 hanbing 的帖子' l. J' w. r/ S3 J* x* w5 a% g  K$ e
# o- e4 ~( B1 k" ^7 A5 k8 U/ {6 |; h
389439694
8 d- ]3 z2 t7 q* K2 w4 c8 n前些日子忙别的事 没怎么上网
1 B3 @. P( `8 h6 ]7 H' v5 m以后多交流啊

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作者: philexchang    时间: 2010-12-30 16:41

回复 dan 的帖子
, e/ b3 a  ?' P
0 p, i8 i0 y. B. T0 l9 {' e1 |) b请问胰酶浓度多少？

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作者: tingwuyu    时间: 2010-12-31 08:49

0.25%胰酶，细胞已老化，可能传代也没什么改变，若是治疗用，最好取四代前细胞

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作者: 清影    时间: 2010-12-31 08:58

回复 philexchang 的帖子
" C" {6 I, {0 u; v; S" ?! c- t$ R8 v3 g' ]  B
不一样，每个人培养细胞的习惯和细胞的生长状态不一样，所以干细胞传代次数控制也不尽一样，还是要做检测看看才能确定，我朋友他们的是控制在10代以内

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作者: fzfmd    时间: 2011-3-2 12:39

    细胞状态看起来很一般，如果状态好的话还能再长一天传代。消化时胰酶使用终浓度为0.05%，消化时间与细胞状态有关，一般1~3分钟即可（胰酶需37度预温）。

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作者: pekingxiaoe    时间: 2011-3-6 20:57

离心力300g左右

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作者: lydia033rj    时间: 2011-3-14 14:11

第八代长成这样还算可以了，但是已经开始老了，再养下去也没用的，胰酶就是0.25的，我们不用离心，T25的瓶子加进去1ml，平放1min，竖起1min，然后就可以了，但是传到后面这个时间可能会有点偏差，自己试一试吧

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作者: 干细胞工作站    时间: 2011-3-25 00:58

2 Z( s. S  ]' k, h) ?
离心用300g五分钟
. N  ?- ^. U. W" F7 g消化和室温很有关系，还是镜下观察的好，在倒置显微镜下观察，细胞之间有空隙，略变圆，有少量细胞脱落就可以终止
; ?, T2 {) {$ F+ n一般细胞长到80-90%就可以传代，细胞长的太过消化有可能成片脱落

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作者: 水兰色    时间: 2011-4-5 15:10

感觉状态不是太好啊偏老化了，: d" Z% O* N+ V* S! Z6 }! P
胰酶0.25%，根据镜下观察决定消化时间，不超过5min，必要时放入孵箱。6 Y; D7 A& w5 {: p7 D) d* F
离心1000rpm，5min足够了

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