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标题: 求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题（附图） [打印本页]

作者: feifei105 时间: 2010-11-12 10:51 标题: 求助小鼠骨髓间充质干细胞几个问题（附图）

本帖最后由细胞海洋于 2010-11-12 10:57 编辑 + Y( a7 { i' n3 i5 }; U( q/ c9 a
" E. V$ _- i7 e L
本人采用全骨髓贴壁法分离3只小鼠胫骨和股骨，用1ml注射器吸取L-DMEM 10%FBS培养基将骨髓冲洗出来，还用血管钳夹碎骨骺端，1000rpm 5分钟后至12孔板2个孔。3天后首次全量换液，至第5天仍不见贴壁变形的细胞，可能的原因？1. 我由于手法问题，将骨髓冲出时发现有些已凝结，但又尽量将血状絮状物冲碎，我园子里有人这么做也分到好些细胞，不知道这个是不是关键？2. 由于培养液的原因导致细胞贴壁不好（我用的进口血清）？
下面图是第五天的细胞，没有贴壁变形的细胞，请教这些大的圆形细胞（不是血细胞）是什么细胞，我刚取分完时在显微镜下看也都是这种细胞（除了血细胞），只是密度很大而已，所以请各位高手帮帮忙，急死了。

还有一问题想请教：我只追求细胞纯度，想采用Percoll是用1.073g/ml吗？我看有人用1.082g/ml,哪个更好，密度梯度离心适合分离小鼠BMSC吗？用全骨髓培养的BMSC纯度如何？
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作者: 飞翔的十字架 时间: 2010-11-12 13:57

3天后全量换液有点晚，血细胞虽然不贴壁，但是会沉降
我觉得最晚24小时换液

作者: 飞翔的十字架 时间: 2010-11-12 13:59

我最近大鼠MSC养的也不好，不管percoll还是全骨髓2 y) A: ~4 c% V* }
现在正在尝试protocol说的3h换液以后8h换液直到3d
理论上说贴壁细胞2h肯定能贴壁啦不过换液要很小心
下午再尝试下离心的我用的大鼠是1.073

作者: suning 时间: 2010-11-12 16:16

首先，细胞没吹打散。仍有些许细胞聚集。若有血细胞建议裂解，用无菌水几秒即可。大园细胞可能是一些粒细胞吧

作者: daviddow 时间: 2010-11-12 18:05

你用DF12代替那个L-DMEM试试。
血清换成2%。

作者: 267318024 时间: 2010-11-12 18:30

我同学用全骨髓培养法养老鼠的BMSCs养的很好呢，24小时半定量换液，然后隔天换液，用PBS液冲洗，细胞培养出来，都开始传代了，你用淋巴细胞分离液，个人觉得不好，干细胞数量本来就少，还分离了再取，又会损失一部分了，并且培养的环境也破坏了。

作者: feifei105 时间: 2010-11-12 19:24

回复 5# daviddow 3 F Z' M7 O( x! n3 J. }! X/ I$ [
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2%血清可以吗？不会由于营养不够长得不好吗？

作者: feifei105 时间: 2010-11-12 19:25

我觉得这些大的细胞是中性粒细胞之类的，随着换液就都换走了，可为啥没有我的骨髓干呢？是不是有些凝血的原因？

作者: feifei105 时间: 2010-11-12 19:31

回复 2# 飞翔的十字架 + @: k( J  D7 h- N) E1 N) Z8 u! u
5 _$ z# z2 y  d& `/ S
4 I& Y* Y" t+ z8 ^) k  N$ {
谢谢，我试试

作者: feifei105 时间: 2010-11-12 19:32

回复 6# 267318024 * H3 g1 `; u9 S [
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# t! G+ d7 V$ R3 P M1 z/ P+ U
非常感谢，可是我没有贴壁的细胞，是什么原因呢？血凝的原因？

作者: 267318024 时间: 2010-11-12 21:46

2%血清肯定是不够的要么！10%~20%之间，至于没有很好的贴壁，可能是细胞数量太少，还有你的老鼠多大，要是可以直接用裸鼠，效果可能会很好。

作者: liweitiky 时间: 2010-11-13 00:10

回复 1# feifei105
我也养过小鼠的BMMSCs，1，每次培养你应该只取一只小鼠的骨髓，可以取四肢的以增加细胞数量；2，剪刀剪短骨端，冲洗至骨头发白就可以了，不用夹碎骨头的；3，如果有较大的组织块，可以用200目的筛网过滤一下；4，整个过程动作要快，注意避免污染；5，我的三天就能看到长梭型的贴壁细胞。& H$ ~% ]0 r1 O3 \( C1 C0 E. }/ M
仅供参考！

作者: feifei105 时间: 2010-11-13 13:50

回复 11# 267318024
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我的老鼠用一个月，二个月的我都用过，每次取3-5只

作者: feifei105 时间: 2010-11-13 13:54

回复 12# liweitiky

我每次最少取3只，怕细胞数量太少。而且每次取之前给老鼠注射肝素，可还是有血块，是什么原因呢？请问你从处死老鼠后在酒精中泡到冲出骨髓大约多长时间，一点没有凝血吗？

作者: illidancui 时间: 2010-11-14 09:29

回复 5# daviddow

请问为什么要2%的血清呢，有什么特别的好处么？我用的MDEM/F12+10%的.

作者: 阳光飘香 时间: 2011-4-2 18:41

我的情况和你的问题有点相似，不过，我用过红细胞裂解液把血细胞除去了，你的细胞有白色沉淀吗（肉眼可视）？镜下有很多碎片吗？

作者: jj2570782 时间: 2011-4-2 21:58

第五天的细胞怎么还没有长突起

作者: zxdlala 时间: 2011-4-11 17:02

回复 liweitiky 的帖子
' }4 l5 B7 n/ h4 ^9 Y/ r/ z- N
你好，想问下你首次换液的时间，我36小时首次换液还是圆形的。

作者: cheese 时间: 2011-4-11 19:38

回复 daviddow 的帖子 @( o% v# `! p+ K3 C/ I o
) Y R9 E2 g G8 Z n
血清如果换2%会不会太低啊？

作者: cheese 时间: 2011-4-11 19:39

会不会是细胞密度太高了，血细胞太多影响细胞贴壁，而且，细胞密度太高也会产生很多代谢废物啊

作者: 漫游天龙八部 时间: 2011-4-11 22:38

1，建议可以在培养液中加入细胞因子，我开始培养兔间充质干细胞也遇到这种情况，到现在还不知道是什么原因。后来研究室的老师建议下加了因子，解决了,2，凝血可能影响细胞，我在抽取兔骨髓时，将注射器内加入1000单位肝素。
个人意见，仅供参考。

作者: bathpp2007 时间: 2011-4-11 23:25

我也是刚上手，用全骨髓培养。结果还可以。我觉得离心不用太久，我是700r2min。去上清后重悬，多吹打一下，一定要吹打开。接种之后还是能看到很多血细胞，但是24小时换液后未贴壁细胞就几乎消失了。换液的时候我用pbs吹打了两次，每次大概15遍，我觉得间充质细胞24小时可以贴壁的很好了，所以不用担心吹走

作者: 郝晓英 时间: 2011-4-12 11:40

回复飞翔的十字架的帖子5 n2 i3 _/ v! p, |

你好我现在也在养SD大鼠骨髓MSC
方便加我QQ吧：847508395 注一下：MSC啊呵呵
可以讨论一下啊

作者: fengxuan 时间: 2011-4-12 11:49

我首次加20%血清促进贴壁，以后添加10% 血清，有细胞贴壁

作者: lele 时间: 2011-4-13 08:51

我遇到过这种情况，后来查出是血清的原因，换了批血清就好了

作者: athena1988620 时间: 2011-4-13 10:24

我做的大鼠是48小时换液，7天左右才有贴壁的，现在长得还不错你再等几天看看

作者: 若兰汀 时间: 2011-4-15 10:24

我说一下自己的经验，希望对你有帮助。1.老鼠的选取，我用4-6周龄Balb/c雌鼠，c57的细胞活力比Balb/c的强；2.老鼠断颈处死在酒精中浸泡5-7分钟，无菌分离双侧股骨和胫骨，我采用剪掉骨端的骨骺避免有碎的骨渣，1ml注射器吸取DMEM：F12完全培养基冲洗骨髓腔至骨头发白，冲洗的时候最好在培养皿上放一张尼龙膜可以滤过凝固的骨髓块。3.培养基为DMEM：F12+10%FBS；4. 24小时后全量或半量换液；以后2-3天换一次液，小鼠MSC细胞要传4-5代才能尽可能去除杂细胞。你需要保证纯度首先要保证细胞量要大，不然细胞很难贴壁很难养，分离的时候要保证无菌快速否则肯定会凝血凝骨髓。我有同学分离肺部内皮细胞，他在分离前把肝素钠注射到老鼠体内这样避免凝血，你可以试试。祝好运

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