干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

标题: 请教做feeder细胞 [打印本页]

作者: lorey 时间: 2010-11-12 18:36 标题: 请教做feeder细胞

刚开始学习做feeder，总是出现下面几个问题：
1、细胞消化后，特别粘稠，组织块不沉淀（加DNaseI没什么作用）# v) e: q, @" j( `/ E1 k1 c
2、勉强取上清，但是离心后沉淀总是漂浮的
3、铺好的细胞，总是成团生长

各位大侠，怎么解决呢？. x) q, V0 S6 ?) U. K- z: Y" j
另：各位做feeder时，去头尾四肢内脏后消化多长时间？

作者: iseeyou1210 时间: 2010-11-12 18:52

we do 3 rounds of trypsinization and for each time 3 min (mix in between).: m& d8 C$ j ~0 U1 t8 A, _
I used up to 1500rmp (around 500G here) to pellet the cells.
I never remove the head, tail....

作者: 如来的观音 时间: 2010-11-12 19:43

楼上的回答不一般啊，佩服

作者: cony 时间: 2010-11-13 23:06

1，消化完加完全培养基中止时的确会出现一团粘粘的东西，我的做法是用力甩，甩均匀了放一会，等没完全消化的大组织沉下去后再过筛。; G# M; E: k4 N/ W# n/ ~% i6 P/ J
2，如将细胞过筛，不会出现难取上清的问题，存在组织块悬浮等问题。
3成团生长是因为你连组织块一起培养了吧，尝试消化久一点，尽量消化成糜状
4，我一般是剪碎后开始消化30MIN，如果组织块还比较明显，再消化一会，直至大量成糜状/ D1 u0 s' k' @& V, ^1 }1 g f

以上是本人的做法，一般一只孕鼠最少可得90%汇合以上的第二代MEF12个10CM大板。

作者: fespysok 时间: 2010-11-15 16:07

你做的似乎组织块很大啊，问题可能在于你剪的不够碎。我刚做的MEF提取，将去四肢及内脏的胚胎剪碎1000次，之后加入16ml的胰酶消化10min，虽然也出现了胶状物质，但是不多，弃去胶状物质，离心后沉淀还是蛮多的，都是分离的单细胞，贴壁后也没有抱团的样子。

作者: 上海过客 时间: 2010-11-15 16:53

我感觉是吹打的不够。用剪口的枪头充分吹打。 DNA 比较粘，但是断裂了就不粘了。( i; }4 v2 \0 d& f" X( }& {

关键是吹打不够充分。我觉得

作者: iseeyou1210 时间: 2010-11-15 22:53

one more comment, for the cutting the tissue, I always put the embryos insides the 1ml of round bottom cyro-tube and use fine scissors to cut either 100 times or 1min together with 1ml of 1xpbs. the 3 rounds of tyrpsin with 2ml of trypsin in 37 degree (mix 2 times between gently) were performed. inbetween each round of trypsinization, transfer the supernatant to the tube containing the full medium with FCS.6 _$ X7 i% n1 m9 \. }1 t. `
then pellet the cell ........

欢迎光临干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)