/ H% J. ^; q5 z1 o1.3.6诱导后细胞的鉴定细胞免疫荧光和流式细胞术联合鉴定。细胞免疫荧光的抗体选择粘蛋白4和角蛋白4，流式细胞术检查结膜特异性标志粘蛋白4和角蛋白4在诱导前后的变化。 . @% O+ n! l3 r% {6 r8 f* k! z! p. H+ K( L8 u+ f2 s
2结果 4 b! t$ t# m% z2 r$ B4 D+ r5 G& N1 @- h 2 m9 p! g: W8 g4 D/ m( z( e8 V; U }2.1恒河猴皮肤表皮细胞倒置显微镜观察% v) t2 I, ?2 z, R x X7 y
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消化培养法培养的原代细胞在24~48 h贴壁，混杂有成纤维细胞、毛囊等结构，细胞生长旺盛，3~4 d融合，传代后细胞约需3~4 d达到融合，在传至第3代时，细胞基本纯化为表皮细胞，细胞形态为多角形，排列致密。! K. e9 c$ C9 x. D u
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2.2恒河猴皮肤干细胞的鉴定 1 b" \3 I# }$ |( c" F) Q1 A ( p+ \: S o7 Z( F) j$ T经Ⅳ型胶原粘附纯化后的快吸附细胞，胞体较慢吸附细胞小，形态较圆，饱满，胞核大，胞浆少。流式细胞仪检测纯化前后的细胞中角蛋白15和β1整合素表达的比例：在纯化前，角蛋白15阳性细胞的比例为8％，β1整合素阳性细胞的比例为10.7％；纯化后，角蛋白15阳性细胞的比例为89.4％，β1整合素阳性细胞的比例为88.5％。细胞免疫荧光法显示纯化后的细胞胞浆同时显示角蛋白15和β1整合素阳性颗粒（图1）。RT－PCR检测显示角蛋白15和β1整合素均显示明亮的特异性条带（图2）。/ X$ Q$ W; d& F" h2 B( n0 P* [
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2.3Hoechst33342标记恒河猴皮肤干细胞0 z4 A4 {+ \- y* ]
/ c* E7 [+ P" HHoechst33342标记皮肤干细胞后，未见对细胞有明显毒性，细胞无污染、过度死亡、衰老、分化等情况。标记后，立即用倒置相差荧光显微镜观察，在紫外光激发下，细胞胞核呈现蓝色荧光（图3），细胞标记率为100％。随标记时间延长，细胞荧光逐渐减弱（图4），但是，在实验的10 d内，Hoechst标记细胞胞核都可见蓝色荧光。另外，活细胞在观察过程中，被紫外激发光激发后，随激发时间延长，胞核荧光明显衰减。" M& _' s$ ~5 D6 p+ K) U* `) n
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2.4Transwell共培养系统诱导皮肤干细胞! W$ I/ z& ]3 W% P6 m. U& }
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Transwell下层的部分细胞逐渐向终末分化，胞体变大，呈现多角形外形，排列较为松散。 7 F* N; C0 R- l/ G ! e m, Y: Z3 n) C2.5诱导后细胞的鉴定0 w; [: ~0 t( c# X! S9 M
1 e: k) e9 t; n5 s5 M& O2.5.1细胞免疫荧光诱导10 d后，进行粘蛋白4和角蛋白4染色，阳性对照选取正常第3代结膜上皮细胞。诱导后的皮肤干细胞与第3代的结膜上皮细胞，皆显示胞浆角蛋白4和粘蛋白4阳性（CY3标记），皮肤干细胞除了显示红色荧光，还显示胞核Hoechst 33342的蓝色荧光。在形态上，皮肤干细胞诱导10 d后，仍部分显示干细胞特征，比第3代结膜上皮细胞圆，且胞核大，胞浆较少（图5）。 J* n' r$ |9 F
) u. w% z( U% u, N7 `* E2.5.2流式细胞术收集诱导前后的细胞，用流式细胞仪分析粘蛋白4、角蛋白4阳性细胞的比例，诱导前粘蛋白4、角蛋白4阳性细胞 ) [9 f4 Q g+ Q" b, x6 p/ m" C( a3 R7 H6 a t/ c
3讨论8 S! C3 I& r2 k0 `) e& }
- E B I3 ]( |7 e; u皮肤是人体最大的器官，表皮是典型的能够自我更新的组织，小鼠的表皮7 d更新一次，人的表皮60 d更新一遍。皮肤组织特异性干细胞，在维持表皮的自我更新，保持皮肤正常的表皮结构与功能方面起着重要作用。皮肤干细胞在组织结构中位置相对稳定，主要分布在毛囊隆突部（皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘）和表皮的基底层[4]。4 r7 L% b$ H) Z0 }9 B( y
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对皮肤干细胞的纯化有多种方法，常用的有根据细胞的表面抗原应用流式细胞术分选、免疫磁珠分选法，以及根据干细胞的粘附特性用Ⅳ型胶原分选。Ⅳ型胶原分选法是根据细胞是否能迅速（20 min以内）粘附在β1整合素的配体—— Ⅳ型胶原上，而分离纯化细胞。本研究应用Ⅳ型胶原分选法，同前两种方法相比，该方法简便易行，对细胞损伤小。并通过流式细胞仪检测了纯化前后β1整合素和角蛋白15阳性表达细胞的百分比，明确纯化后干细胞比例接近90％。 M2 ]; ~9 n/ `) A5 l( t. u/ t! b5 i
关于皮肤干细胞的表面分子标记仍是一个有争议的领域。普遍认为β1整合素可以保持角质细胞在未分化状态，通过MAP激酶信号调节角质细胞和其他细胞的分化。整合素使细胞停留在组织里正确的位置，整合素表达的丧失或改变则导致干细胞的分化或凋亡[5]。目前，β1整合素作为克隆形成细胞的标记已经被用作其他鉴定标记的基础。为了提高鉴定的灵敏性和特异性，往往采取几种标记联合应用的方法。角蛋白15是最近发现的在毛囊隆突部表皮干细胞高表达的另一种分子标记[6]。本研究采用β1整合素联合角蛋白15两种分子标记，分别通过细胞免疫荧光、RT－PCR和流式细胞术3种不同的方法，从形态免疫学水平、RNA水平和蛋白水平检测了这两种标记的表达，明确鉴定了表皮干细胞。! i; e$ X# n2 ?) }/ M$ H' C p
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人们的传统观念认为成体干细胞局限于生成他们所在组织的分化细胞类型。直到1997年的核移植实验发现成体干细胞的胞核能被重新编排发育程序[7]。自此，一系列实验证实，从一个组织来的成体干细胞不仅能分化成该组织的分化细胞，而且能被诱导分化成另外一个组织的分化细胞，即成体干细胞的可塑性。这些研究结果打破了成体干细胞发育限制性这一传统观念。 \, \% r+ }, b# ^# W$ Z : B/ T' p/ U) S* W2 s' j9 S皮肤干细胞作为一种成体干细胞，同样有可塑性。研究证实，在适宜的实验条件下，人皮肤干细胞能转化角膜上皮细胞[8]。与皮肤干细胞、角膜上皮细胞一样，结膜上皮细胞在胚胎起源上也来源于体表外胚层，具有转化的可能性。我们设计本研究，用灵长类动物恒河猴的皮肤干细胞，体外与恒河猴结膜上皮细胞进行非接触共培养，观察在结膜上皮细胞生长的微环境内，皮肤干细胞是否能向结膜上皮细胞横向分化。本实验选取的结膜上皮细胞的分子标志是黏蛋白4和角蛋白4。粘蛋白4在胃、肠、胆囊等黏膜组织广泛表达，在眼部的角膜和结膜上皮皆有表达，尚无研究表明在皮肤上皮有表达。而角蛋白4是一种细胞骨架蛋白，特异性表达于结膜上皮[7]。通过对这两种分子标志的细胞免疫化学和流式细胞术检测，证实恒河猴皮肤干细胞通过Transwell共培养系统，与结膜上皮细胞共培养后，从不表达这两种蛋白分化为表达这两种蛋白的细胞，为转化为结膜上皮细胞提供了有力的证据。 6 q0 B5 u: p0 v3 D1 x% v. W, K8 @1 {! n6 y# k$ H/ R
在干细胞的横向分化研究中，常有关于诱导后细胞来源的疑问，即是否存在共培养系统中诱导细胞对被诱导细胞的污染，转化后的细胞是否确实来源于干细胞。所以，对干细胞的示踪是一个重要问题。本研究采用Hoechst 33342标记细胞胞核。Hoechst 33342是一种DNA染色剂，主要与A－T碱基对结合。Hoechst几乎能染所有的细胞胞核，对细胞毒性小[10]。目前，Hoechst 33342被广泛应用于标记胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞、皮肤干细胞等[10,11]。Hoechst 33342标记细胞在荧光显微镜下可以直接观察细胞，对细胞毒性小，标记细胞阳性率高（100％），不需筛选阳性细胞；缺陷是：①细胞在活体观察时，经激发光激发后，荧光逐渐减弱；②皮肤干细胞能逐渐排出Hoechst 33342，标记的细胞荧光随标记时间延长而逐渐减弱。但是，在本实验进行的10 d内，皮肤干细胞的Hoechst虽有衰减，仍保持了胞核的蓝色荧光。) V) ?1 a! k3 ]+ h
! g+ E' n! w, @0 k4 q# @本研究通过把带有Hoechst 33342标记的恒河猴皮肤干细胞在体外横向诱导分化为结膜上皮细胞，为组织工程结膜提供了新型的种子细胞，并为严重结膜损伤眼表疾病的治疗展示了曙光。 ! b; ?# _" Q5 a8 U4 `5 p7 E# { 【参考文献】 5 M/ ~6 g3 z4 L* l, b! n( k2 N龙崇德，葛 坚，高前应，等. 胚胎干细胞联合羊膜移植治疗早期严重眼化学伤的实验研究[J].中山大学学报：医学科学版，2005，26(2)：188-192.5 O3 l1 N. k( A J. A) }2 R- ~. c
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黄丹平，郑建梁，高前应，等.兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究[J]. 中山大学学报：医学科学版，2006，27(1)：24-28. " U# {- ?# j* ~9 S# e H/ t6 F ) d# r* ~6 f9 k ' ^' r/ P5 o8 Q% t+ F% ^4 j9 X+ [/ S; W
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张仁礼, 李海标. 胚胎干细胞源表皮样干细胞分化潜能的初步研究 [J]. 解剖学报, 2004, 35(1): 65-68.作者: 陈晴 时间: 2015-5-26 19:07