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标题: 染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~ [打印本页]

作者: deron 时间: 2010-11-17 14:03 标题: 染色专题汇总——冀望集大家之力整合现行所有染色剂，从细胞到分子，从配方到原理~

本帖最后由 deron 于 2010-11-17 14:17 编辑
, w! ]# `8 t; b
坛子里总是卧虎藏龙的，第一次搞这种集合贴，希望大家鼎力支持。
“台盼蓝、瑞氏、茜素红、苏木素、油红、溴酚蓝、HE、碱性磷酸酶、vokosa结节染色、免疫荧光染色、阿尔辛蓝、考马斯亮蓝、ACP染色、AKP染色、Brdu 染色、免疫组化染色、结晶紫……”! f7 \$ u. s; Y) h& u3 M6 D
从来没有注意到有这么多的染色剂，自己用到的也是屈指可数，掂量了很久，决心整理出来一份完整资料。; e9 J$ W5 z: O* [! t
希望大家多给资料和意见~

作者: deron 时间: 2010-11-17 14:06

http://v.youku.com/v_show/id_XMTc1MDQxMjU2.html，这里有一个台盼蓝的染色操作视频。

作者: deron 时间: 2010-11-17 14:09

本帖最后由 deron 于 2010-11-17 14:24 编辑 7 d/ w8 R2 U5 E0 l/ ~

台盼蓝——检测悬浮细胞存活率3 q4 B% I& d* j$ N

基本性质：台盼蓝（Trypan Blue，也称Direct blue 14），或称台盼兰、锥虫蓝
　　    分子式：C34H24N6O14S4Na4
　　    分子量: 960.82
　　    可溶于水（10mg/ml)。

原理：通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，这被称为染料排除测试（dye exclusion）。

步骤：(来自supergama)1 j% T, }4 d$ r& O3 V
1、4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）
2、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。/ v* s( O8 B9 x: e( C/ F, W
3、染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。（终浓度0.04%）
4、计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
5、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
6、统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%1 T" s; h" l8 x

注意：
1.台盼蓝染细胞时，时间不宜过长，3分钟以内。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。- n# E( p/ F) M: e
2.充分混匀细胞悬液,保证细胞分散良好，呈单细胞。- ]& ]" W1 N& b& U$ ^4 D
3.细胞计数时：计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。2个以上细胞团按单个细胞计算，细胞团应<10% 。
4. 凋亡小体也有台盼蓝拒染现象，因此该方法不能用于区分正常细胞与凋亡小体。2 ]+ S# c* L7 b2 Z' ], o+ ?& d
5.台盼蓝有潜在的致癌性，需戴手套操作。/ C9 p1 L! ^& T' {
6.细胞数较多时，可先拍照再计数。

作者: deron 时间: 2010-11-17 14:13

求战友资料支持，求斑竹威望支持

作者: yuhaoze 时间: 2010-11-17 16:17

Hoechst 33342/ M5 v- t3 [3 Y& L/ f6 E- l: A
用于凋亡检测的染色剂

1.htmlØ Hoechst 33342，也称bisBenzimide H 33342或HOE 33342。分子式为C27H28N6O•3HCl•3H2O，分子量为615.99，CAS Number 23491-52-3。 Ø Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。 Ø Hoechst 33342染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33342也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。 Ø Hoechst 33342的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33342和双链DNA结合后，最大激发波长为350nm，最大发射波长为461nm。 Ø Hoechst 33342溶于水，溶解度可达20mg/ml。 Ø 用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33342工作浓度为0.5-10微克/毫升。荧光染料Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。而PI染料是不能进入细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中，即活细胞对PI染料拒染，而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被PI染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI染料对凋亡细胞进行双染色，就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst 33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。使用说明：1.对于固定的细胞或组织： a.对于细胞或组织样品，固定后，适当洗涤去除固定剂。随后如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行Hoechst 33342染色。如果不需要进行其它染色，则直接进行后续的Hoechst 33342染色。 b.对于贴壁细胞或组织切片，加入少量Hoechst 33342染色液，覆盖住样品即可。对于悬浮细胞，至少加入待染色样品体积3倍的染色液，混匀。室温放置3-5分钟。 c.吸除Hoechst 33342染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。 d.直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。 2.对于活细胞或组织： a.加入适当量Hoechst 33342染色液，必须充分覆盖住待染色的样品，通常对于六孔板一个孔需加入1ml染色液，对于96孔板一个孔需加入100微升染色液。 b.在适宜于细胞培养的温度培养20-30分钟。弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次即可进行荧光检测。

海洋哥！！！给我2个威望！！！我就升级啦！！！！！
哈哈哈啊哈

作者: jhu132llh 时间: 2010-11-17 19:47

考马斯亮蓝染色! a; k# ~: m) ^. J+ e

配方：. _2 J: f. g! u
考马斯亮蓝R-250染色液配方如下：' c9 }: X! m' ]# g
考马斯亮蓝R-250 1g
250ml 异丙醇
100ml冰醋酸3 o d6 J& J# ?
加650去离子水6 P! j0 f. D+ s) `

考马斯亮蓝染色法是1976年Bradform建立。考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）。
) l# Q" }4 C7 A
染色方法：
1. 常规染色脱色方法：
a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。3 q( P; p2 s' i
c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。# e; p. x7 Y5 S: L) B" f) b
e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。, V6 _( s1 m8 V/ O' ~( P3 C
注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。* {( [7 y2 i$ U! R* G6 n- U, U, I$ \
f．完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。

2. 快速染色脱色方法：0 I. w3 H- L9 ^0 P2 @
a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。4 ^+ r! Q! x' b/ ?
b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。# K5 D, _ T+ h9 _) P
c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。
f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。% j9 [6 v# ^1 [, N* ^
g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。
h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。" k) Z+ ^0 f1 a, e4 h
另附：常规染色脱色方法耗时较长，但检测灵敏度更高，染色效果更加稳定。快速染色脱色方法通常检测灵敏度略低，并且在微波炉加热的过程中有时会出现暴沸导致凝胶碎裂的情况，需特别注意。另外微波炉加热导致的高温会引起染色液和脱色液中的乙酸的挥发，最好能在通风橱中进行。

作者: jhu132llh 时间: 2010-11-17 20:09

苏木精染色% D7 f4 T; f  I. B8 s/ b: D
【中文名称】苏木精
【英文名称】hematoxylin;h(a)ematine
【性状】! _. N8 P9 ?* M5 [2 a* [2 @
  无色棱形晶体，遇光变红。9 [; C  T" E+ c- B1 v/ m/ H
【溶解情况】
  难溶于冷水和乙醚，易溶于热水和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。% {: N) C1 {* T+ l
【用途】( @$ n5 v9 h5 h/ {8 J
  一种天然媒介染料。用于蚕丝、毛皮和皮革的染色以及棉布的印花，用不同的媒染剂可得到蓝色或黑色。与重铬盐、铁盐、亚铁盐、铝盐和锡盐等一起可制成各种色淀。在分析化学中用于比色分析、显微镜分析，并用作pH值指示剂，变色范围5.0～6.0，由黄色变紫色。苏木精(hematine)为碱性染料,将细胞核染为蓝色;/ m3 n  T/ m5 ]0 d+ o; N
【制备或来源】8 O( A; n; Q5 f- }+ @6 ?
  由苏木树的木材获得。7 P" P( E2 |: w- {; c8 }% P" R
【其他】
  含有3分子结晶水，在100～120℃溶于本身的结晶水中。在水溶液中，特别是在碱溶液中易被空气氧化成红棕色的氧化苏木精。
  常与伊红配合，苏木精将细胞核染成蓝色，而用伊红（署红）将细胞质染成红色。
  溶液要避光保存。7 z! U$ y& z$ e

配方：
苏木精的染色液有很多，如通用的苏木精染色液和各种改良后的苏木精染色液等等。: t$ l) n6 H0 b% {9 j" p. L. B8 Y
一，改良的苏木精染色液一8 Q* v, M- L. r6 x% V
材料苏木精2g，无水乙醇250ml，硫酸铝10g，蒸馏水750ml，碘酸钠0.5g，柠檬酸1g。方法将苏木精溶于无水乙醇，将硫酸铝溶于水，两液混合加热煮沸2min，加入碘酸钠及柠檬酸。优点此液存放时间长，染色力保持时间长，染色效果好。! e! R$ u7 g9 ~1 b8 P3 Z
用硫酸铝替代钾明矾染液久放也不会产生沉淀、结晶，不用过滤即可使用。此液存放时间长，染色力保持时间长，经过我室比较，使用时间可比哈瑞氏苏木精染液长一倍。1g苏木精配置的染液是哈瑞氏苏木精染液的两倍，更加经济实用。此液染色效果好，染色时间3～8min，特别是染色质显色清晰，但应注意一些染色技巧，配置盐酸酒精分化液时，浓度稍低，一般控制在0.8%左右，分化时间稍短，应在30s之内。氨水配制成1%，返蓝时间要较长，一般控制在1～2min，充分水洗后再进行下面的染色。

二通用海登汉氏苏木精染色液2 p! \0 J( t: P
海登汉氏（Heidenhain's）苏木精染色液，又称铁矾苏木精染色液。
配方：甲液（媒染剂）：硫酸铁铵（铁明矾）2-4g ；蒸馏水100ml （必须保持新鲜，最好临用之前配制）。; Y5 E0 m( I, R  T( x+ D
乙液（染色剂）：苏木精 0.5-1g ；95％酒精 10ml；蒸馏水 90ml
配制步骤：
（1）将苏木精溶于酒精中，瓶口用双层纱布包扎，使其充分氧化（通常在室内放置两个月后方可使用）。1 r0 m4 P  E: \% b, w6 g5 b
（2）加入蒸馏水，塞紧瓶口，置冰箱中可长期保存。 ' P+ |0 L; ~( F: g# U4 R8 K
切片需先经甲液媒染，并充分水洗后才能以乙液染色，染色后经水稍洗再用另一瓶甲液分色至适度。铁矾苏木精染液为细胞学上染细胞核内染色质最好的染色剂，但要注意甲液与乙液在任何情况下决不能混合。" v: [8 q. ^& P

配方三：苏木精水溶液
0.5g苏木精溶入100ml煮沸的蒸馏水中，静置24h后可使用。

配方四：代氏苏木精（Delarfield’s haematoxylin）
甲液：苏木精1g + 无水酒精6ml
乙液：硫酸铝铵（铵矾）10g + 蒸馏水100ml
丙液：甘油25ml + 甲醇25ml
分别配制甲、乙两液，将甲液一滴滴地加入乙液中，充分搅拌后，放入广口瓶中用纱布蒙住瓶口，置于温暖和光线充足处7~10天，再加入丙液，混匀后静置1~2月，至颜色变为深紫色后，过滤备用，可长期保存。   T1 F5 A9 y  c4 j

配方五：爱氏苏木精（Ehrlich’s haematoxylin） 0 B' s& a, d! n5 B
苏木精1g + 无水或95%酒精50ml + 蒸馏水50ml + 甘油50ml + 冰醋酸5ml + 硫酸铝钾（钾矾）3~5g。配制时，先将苏木精溶于酒精中，然后依次加入蒸馏水、甘油和冰醋酸，最后加入研细的钾矾，边加边搅拌，直到瓶底出现钾矾结晶为止。混合后溶液颜色呈淡红色，放入广口瓶中，用纱布封口，自然氧化1~2月，至颜色变为深红色时即可过滤备用，可长期保存。
, K- {' o( m2 Z- K7 X0 |/ M
1 X" g; g; b" x
1 W% g" J& K; v( `

染色方法：
一石蜡切片的苏木精-伊红染色法2 V3 z, I  `' N- c6 h
（1）切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟。
（2）移入二甲苯和纯酒精（1∶1）混合液中5分钟左右（如经二次二甲苯脱蜡，此步可略）。
（3）入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5分钟。最后经蒸馏水转入染液。+ w  W2 L# g/ {+ i
（4）苏木精染液染色5～15分钟。、
（5）水洗玻片上多余染液，0.5～1％盐酸酒精（70％酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟。
（6）流水冲洗15～30分钟，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。（7）蒸馏水短洗。
（8）0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟，若着色困难，可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。
（9）依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟，在95％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。) }2 ~, p" l4 P" r+ B( U
（10）二甲苯透明（二次），共约10分钟。
（11）封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。) s' S7 y$ H# d( |- N

还有其他很多的苏木精染色的方法，主要是用于对染色体的染色，基本方法都差不多，大家实验室都有我就不啰嗦了。

作者: deron 时间: 2010-11-18 09:37

回复 5# yuhaoze & a3 R$ E O/ ?: a, O

. }- E% `6 }# w" X) \
仁兄格式有些乱，不过刚好看了一篇用Hoechst33342染色的文献，多谢！

作者: yuhaoze 时间: 2010-11-18 09:44

回复 8# deron

6 I$ q$ G2 U( Q$ c
我也是从网上转的，呵呵，不过做凋亡没必要用 hoechst。AO，EB已经很好了，便宜，实惠，好观察，又不用流式。无非有点毒性，注意点就是了。

作者: deron 时间: 2010-11-18 22:35

瑞氏染色液(Wright’s Stain Solution)——细胞形态学染色，实验、临床检验常用

简介8 z0 q0 Q0 \4 ]( ]# u
由碱性染料美蓝(Methylene Blue)和酸性染料伊红(Eosin Y)混合配制而成，也称伊红－美蓝染料。其中美蓝为碱性氯盐，呈色部分为阳离子，阴离子无色；伊红的有色部分为阴离子，阳离子无色，其有色部分为酸性，故习称伊红为酸性染料。0 x' ?" ~5 r( `7 ^) [) K
新配制的瑞氏染液染色效果较差，久置, 因其中的美蓝被氧化而含有天青，美蓝天青与伊红能使细胞核染成紫红色，而多余的美蓝则可以使胞浆染成蓝色。化学作用为主，伴有物理亲和反应。
! `; U7 N2 f8 o+ a9 g( S* ^
染色原理：& W, @) Y' p- i: h
各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质。
原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。! s5 T7 R. F, M

pH的影响（pH6.4～pH6.8）
细胞各种成分均属蛋白质，因蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。1 S; D% l5 A8 [! _
| D6 x* p I; p+ U2 ?' ~
瑞氏染液的配制：" Q8 ~3 {/ v( f: N* N
取瑞氏染料1.0g、甲醇600ml、甘油15ml。. L! g& L4 u% U5 w6 S& y1 Q- c0 s
I液：将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨(至少半小时)，以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油，密闭保存。这便是配制的。
（新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青愈多，染色效果也就越好。但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发或氧化，同时也可使血细胞染色较清晰）
II液：又称磷酸盐缓冲液(PH6.4~6.8)，包含磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH。

染色步骤
1. 按常规方法制备血涂片，待血膜干后——
2. 滴加染液，使覆盖全部血膜，30秒至1分钟后滴加等量的磷酸缓冲液（pH6.4~6.8），轻轻摇动载玻片，使缓冲液和染液混合均匀，此时出现一层灿铜色浮膜(染色)。
3. 染色3～5分钟后，用自来水缓慢从玻片一端冲洗(注意勿先倒去染液或直接对血膜冲洗)，凉干后镜检。

染色注意事项 ; ^3 @2 i% X% Z* p8 }6 u
1.血涂片干透后固定（可以考虑使用多聚甲醛），否则细胞在染色过程中容易脱落。 + q. a& c# ~0 M- D! ]( m! u9 M9 M
2.冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。 " y1 \$ `# X+ Y6 ~' O, H' y
3.染色过淡可以复染，（可以考虑针对性使用其它染料如苏木素）。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。 . l& b9 S( F& u) A7 z$ [
4.稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色呈色异常，形态难以识别，甚至错误。

作者: deron 时间: 2010-11-19 20:27

整理资料很累，大家多给些意见，多一些支持

作者: lipd09@mails 时间: 2010-11-19 21:39

碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
以ALP为目标物的检测方法：
1 Gomori钙钴法
【染色原理】 1 ~# w$ m! H6 P; \: \5 H& U$ ?
ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】  6 w' D! [! \3 [9 ?# g0 B1 `: J% a
3%β-甘油磷酸钠5ml  2 H, o! a# I3 Y
2%巴比妥钠5ml  . W5 x4 W! j5 X7 t4 x6 ^
蒸馏水10ml  7 `- u/ I/ b, }" V0 I- M
2% CaCl2 10ml
2% MgSO4 1ml
【步骤】  3 A- {4 u* G0 y
（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。  % V3 N( D) a/ C) ^
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。  ; ~  J6 h+ S* @- u1 |# i6 s0 O* o
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。  7 C- v' u6 ?8 p# O
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。  + F/ K! t  i" e4 F5 X! Y/ B
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2 U8 N$ F' n8 N' z
2 偶氮偶联法：
【孵育液配制】 6 i- K" E) y) u" [/ y6 r
萘酚AS-BI磷酸盐 20mg
DMSO 0.5ml  ) c1 {2 z5 S, l( ]; ^% d
0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2） 50ml
六偶氮副品红0.5ml  & U; V4 D5 n0 a7 J) R2 G1 n, t
1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）  " `4 W2 s3 F* v( c& d8 u5 O
【步骤】  ! W( m0 J6 V% }+ }  g1 a4 D
（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。
（2）蒸馏水冲洗。
（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。  * n5 Q; B! T( X4 [/ O  Q+ A
（4）流水冲洗，晾干。  1 y( ]/ U7 p  K  ]2 D
（5）甘油明胶封固。
【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。
" V/ j- B9 f+ l/ N, {9 f( p& @
3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：  4 B$ j0 E% m: e6 H  N7 D3 w$ ]; i( Y
【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。
【作用液配制】
取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。  3 `  r; M' d0 A7 q+ R7 I/ |" o# `
【步骤】
（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。  & }4 |, V5 I3 ]1 S7 g: Z9 X, _+ `
（2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。
（3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。
【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。  , U8 d5 @: @5 _5 y+ f- \
, b- d; o( L7 C$ n; M4 R

针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：  6 _6 ]( p! T0 |7 F

4 茜素红法
【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。
【步骤】
（1）培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。
（2）0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。
（3）蒸馏水冲洗，干燥，封片。  ; ?7 B  D# u* l9 U
【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。  ' O+ Q- G& _2 {4 W5 R5 W: T
# {. }$ R+ p: N% @8 T% Y0 x0 r
5 von Kossa法
【作用原理】  - e3 D% g5 x5 C) f, K' q
Von Kossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。
【步骤】  ' z7 I$ M% C9 @" b0 L1 \& B. u
（1）培养皿用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。
（2）培养皿中加入5％硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。
（3）倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。
（4）培养皿中加入5％硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。  ( y* N9 ^# x6 {9 ^6 V- R+ R
（5）室温下晾干，封固。

作者: deron 时间: 2010-11-20 09:45

多谢yuhaoze、jhu132llh、lipd09@mails几位版友的资料，整理结束后我会把完整版给大家传一份。

作者: deron 时间: 2010-11-20 20:37

接下来介绍吉姆萨染色，论辈分吉姆萨应该是瑞氏他弟，因为吉姆萨的组成为伊红、天青，瑞氏为依红、美蓝，而天青正是美蓝的氧化产物。. W, y' m% {7 f! [# d; s
比较让人不解的是，吉姆萨比瑞氏要来的娇弱一些，它的工作液为了防止二氧化碳酸化，需要现用现配。瑞氏却是在瓶中放置时间越久越好用，不知道坛子里的大虾们有没有能够解释为啥美蓝不怕酸化的。

作者: deron 时间: 2010-11-20 20:41

吉姆萨染色——瑞氏染色他弟3 W, q3 l% E! I% i2 {6 {1 R7 H
* Z: O" l/ x! E/ U% Q
染液组分3 B# Y4 U* y- C0 Y
吉姆萨染液由天青，伊红组成。
/ b  l( {+ b; p* q
染色原理* B3 g' O9 G. l
嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；
细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；1 k2 e; c( K7 [- {1 Y2 l! A
中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。1 N8 O! R) _* Q

染液配制! q* h# J# z4 o9 q5 w
配方一：6 b- z4 r' W/ K8 X4 R* t
1. 取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油中，置于60℃温箱，约3h后溶解。
2. 取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶中长期保存。
3. 母液与0.1mol/L的PBS（pH6.9~7.2）按1:9混合即成工作液。工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。0 L$ I2 Q3 i+ z% t' Y/ {" C
配方二：$ c: c2 ~' _, s& H  w
1. 吉姆萨干粉1.5g，甘油（分析纯）50ml，甲醇（分析纯）50ml。配时先将Giemsa干粉倒入研钵内，加进少量甘油，仔细研磨约半小时，至无颗粒状为止。
2. 把剩余甘油全部倒入研钵内磨匀，然后装入棕色试瓶中，置约60℃温箱中保温2小时，再加入甲醇，混匀后贮存备用。# x7 a6 i2 @+ Z# O& ^
3. 同配方一。
配方三：
在没有优良吉姆萨染料时可以采用：天青Ⅱ一曙红盐3.0g, 天青Ⅱ0.8g，甘油250ml，甲醇250ml。配时取天青Ⅱ一曙红盐和天青Ⅱ结晶置于干燥器中充分干燥后倒入研钵中加甘油充分研磨，再加入甘油和甲醇，后续过程同配方二。2 r9 u  h% @- |/ C
5 F+ D# t+ k" l1 x% I# S2 k
染色程序
1．标本用甲醇固定5~10min。4 [, {( h7 [- |! m
2．吉姆萨染色10~15min——可用染色缸或者染液滴覆于标本。
3．自来水冲洗掉红色背景。
4 z. t# B: a, g; Z
注意事项
PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均含蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用片必须清洁，无酸碱污染。配制染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常。

作者: deron 时间: 2010-11-23 08:09

接下来本应该是HE染色，该染色可分解成为苏木精染色+伊红染色，所以在HE之前，我们先了解一下苏木精染色、伊红染色，顺便再补充一下前面提到的美蓝和天青。

作者: deron 时间: 2010-11-23 08:25

本帖最后由 deron 于 2010-11-23 08:27 编辑 ! Y/ B$ O5 p, ^6 c" t; T: m* k/ z

苏木精——主要用于细胞核染色
版权很大部分来自于“中山大学医学院病理学教研室凌启波”
一、苏木精的性质
苏木精，又称苏木素，苏木色精（Hematoxylin）,C16H4O6，分子量302.288。无色或淡灰黄色粉末，市售有无水和含3H2O两种；易溶于乙醇、乙二醇和甘油，微溶于水；本身不是一种染料，没有染色性能，经过氧化和媒染后，才成为一种很好的细胞核染料。
苏木精不是一种活性物质，从分子结构上，苏木精没有发色团，所以没有染色能力。但其溶液放置后，由于氧化作用形成苏木红（hematein），才成为一种染料。
醌型苯环是一个发色团，这样，在苏木红的分子结构中，原有助色团羟基，又有了发色团醌型苯环。7 W7 c4 v* P( O; E
- g8 a3 _) Z) A0 D. n

& J' G% ?+ [; G1 ]% g7 V# s; `+ l
二、苏木精的氧化
苏木精的氧化有两种方式：
1.自然氧化：通过空气和阳光的作用而被自然氧化成苏木红，过程数周至数月。这种染液的保存和使用寿命较长。
2. 人工氧化：配制染液时加入一定量的氧化剂如氧化汞、碘酸钠、高锰酸钾或过氧化氢等可立即使苏木精氧化成苏木红。但要注意加入氧化剂过量时会造成氧化过度，破坏了苏木红的分子结构，导致苏木精液的染色力减弱甚至失效。
成熟的苏木精染液是苏木精、苏木红、苏木红的活性氧化产物和非活性的超氧化产物的混合物。( `( g$ b$ U& h5 I$ O- y
早期传统用氧化1g苏木精所需氧化剂的量是：氧化汞 500mg 、碘酸钠 200mg 、高锰酸钾 177mg 、过氧化氢 2ml，但问题是染液使用寿命不长。
近年有学者提出用较少量的氧化剂来配制苏木精染液，其染色效果亦佳，苏木精染液的使用寿命延长。他们推荐1g 苏木精所需氧化剂的量是：氧化汞 100mg、碘酸钠 40~100mg、高锰酸钾 90mg 、高碘酸钠35mg、碘 200mg 、高碘酸钾 50mg: ?7 r" W/ Q! B) A  F" S
理论上，1g苏木精•3H2O完全氧化成苏木红需用碘酸钠185mg，而1g无水苏木精完全氧化则需用碘酸钠218.2mg。Gill提出半氧化苏木精法，即氧化1g苏木精仅用碘酸钠100mg，这样先使部分苏木精氧化成苏木红，未被氧化的苏木精在随后的日常染色操作中慢慢氧化成苏木红。这样，染液既不会过染，又经常有新的苏木红形成补充，苏木精染液的使用寿命就可延长。
苏木精的氧化与下列因素有关：3 |" `1 {" T. T* y# `* J. k
1.苏木精染液PH值。染液偏碱性氧化快，中性时稍慢，酸性时很慢，所以加酸时的苏木精染液可延缓氧化。# x$ y% b* x8 J% u0 A
2.氧化剂的量。加入人工氧化剂后苏木精可立即被氧化成熟可用，自然氧化和供氧量有关。如靠近阳光、染液通风、经常摇动等可加速氧化。
3.氧化时苏木精液的温度。用碘酸钠等作氧化剂时，在常温下加入即可，而用氧化汞作氧化剂时，需把苏木精液煮沸时加入才能放氧。
三、苏木精的媒染
苏木精被氧化成苏木红，苏木红为弱酸性，呈红色，对组织的亲和力很小，用单纯的苏木红液染组织，和一般酸性染料一样呈弥漫性染色，且染色浅淡。但当加入某些物质如二价或三价的金属盐如铝、铁盐后，染料分子就能与这些金属盐的离子结合形成色淀（lake），这种色淀具有阳电荷，能与特定的组织成份牢固结合。这些二价或三价的金属盐就称为媒染剂（mordant）。用作媒染剂的多是二价或三价的金属盐如铝、铁盐，也有采用碘、钨、钼、锂、铅和铬等。
常用的媒染剂有：
硫酸铝钾又称钾明矾 K2SO4 • Al2(SO4)3 • 24H2O
   硫酸铝铵又称铵明矾  （NH4）2SO4 • Al2(SO4)3 • 24H2O ! q2 t7 G5 c  t7 z6 \: N1 W
   硫酸铁铵又称铁明矾  （NH4）2SO4 • Fe2(SO4)3 • 24H2O + d8 A8 \- ]5 G, F/ c
   硫酸铝             Al2(SO4)3 • 18H2O， & ?0 x  s4 a% g7 A2 L6 M3 w
三氯化铁          FeCl3 • 6H2O
苏木红和这些金属盐结合形成蓝紫色或者蓝黑色的色淀，这些色淀和胞核结合得很牢固，用水或乙醇均难以洗脱，Weigert铁苏木精染液更可以作为耐受酸性分化和用较强酸性染料复染的首选胞核染料。 5 H# n! _; A6 U# L; h
从苏木红的结构式看，原有助色团羟基，又有了发色团醌型苯环，应属一种酸性染料，但由于酸性助色团羟基的酸性很弱，对组织的亲和力较小。加入媒染剂铝盐后，铝盐与苏木红螯合形成蓝紫色的铝-苏木红色淀，该色淀呈强盐基性，带正电荷，作用相当于碱性染料，即带正电荷的蓝紫色色淀和带负电荷的胞核脱氧核糖核酸磷酸基进口极性吸着而完成染色。

1 R8 p. p) Q! `& t
四、各成分作用. N) |7 B, J& K4 s: u6 i% v6 q
1.氧化汞、碘酸钠：作为苏木精的氧化剂，使无染色力的苏木精氧化后转变成有染色力的苏木红。6 ^. s0 C- [! i1 @
2.硫酸铝钾、硫酸铝铵和硫酸铝：作为媒染剂，其三价铝离子与苏木红结合形成蓝紫色的色淀与细胞核内核酸的磷酸基牢固结合。 * o0 B2 z) |) E- f( q9 Z
3.无水乙醇：较快溶解苏木精，并可抑制霉菌生长。
4.乙二醇：也能较快溶解苏木精，抑制霉菌生长，其沸点高（b.p.197.2℃），苏木精液不易挥发。 ' n+ n8 o, m3 E
5. 甘油：作为稳定剂，延缓苏木精染液蒸发，防止苏木精过度氧化，延长苏木精液的使用期。
6. 冰醋酸：可抵销氧化剂的氧化，使苏木精和苏木红保持均衡。同时又可增加胞核的选择性染色，使胞核染色质显示得清晰细致。& d; _+ ^, \9 \+ I, v
7.柠檬酸：作用和冰醋酸相同，加入柠檬酸1g，相当于冰醋酸20ml。
8.水合氯醛：起保护剂作用。
五、简单介绍一种配制——鄂征的改良Mayer法. a5 t3 j( k* R
0.5g苏木精，5.0g铵矾或者钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70ml蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。混匀过滤后为母液，用蒸馏水按1:20稀释即成工作液。

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作者: wang2004k2006 时间: 2010-11-24 09:12

Hoechst 33258细胞核荧光染色液
用于支原体检测
Hoechst 33258，也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式为C25H24N6O•3HCl，分子量为533.88，CAS Number 23491-45-4 。Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。Hoechst 33258也常用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。 Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。 Hoechst 33258溶于水，溶解度可达10mg/ml。用于细胞核染色时，推荐的Hoechst 33258工作浓度为0.5-10μg/ml。
溶液配制：二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst 33258）浓缩液：称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank’s 平衡盐溶液中，在室温用磁力搅拌器搅拌30～40分钟，使完全溶解，－20℃避光保存。二苯甲酰胺荧光染料工作液：无酚红和碳酸氢钠的Hank’s溶液100ml中加入二苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml，混匀，临用现配，此液对光和热敏感。! I6 h& C n/ r1 V3 D( k# D
试验步骤9 M' U2 Z5 ]1 m* t
1 取培养的Vero细胞经消化后，制成每1ml含105的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板，每孔再加无抗生素培养基3ml，于5%二氧化碳孵箱37℃培养过夜，备用。
2 于制备好的指示细胞培养板中加入被检样品，置5%二氧化碳孵箱37℃培养3天。取上清接种到制备好的细胞培养板上培养3天，末次制备好的细胞培养板含盖玻片。吸出培养孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟，吸出固定液，再加5ml固定液固定10分钟，吸出固定液，加二苯甲酰胺荧光染料工作液5ml，加盖，避光室温放置30分钟，吸出染液，每孔用纯化水5ml洗3次，吸出水（一定要吸干净，特别是玻片边缘部分一定要吸干净），盖玻片于空气中干燥（彻底干燥），取洁净载玻片加封片液一滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。* n2 _+ u" S8 o2 Y; j. G
3 用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
4 用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
结果判定
阴性对照：仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
阳性对照：荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。
当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。# n* l+ d# e4 d0 K! t! M) e
如供试品结果为阴性，则供试品判为合格；如供试品结果为阳性或可疑时，应进行重试；如仍阳性时，供试品判为不合格。

作者: deron 时间: 2010-11-24 16:36

回复 18# wang2004k2006 ) M) `( \& a8 `& [, M
& \; ^8 R: Q1 o. \. z: @' z, |

多谢支持，坛子里很火的那篇“Organ reengineering through development of
a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix”用了Hoechst33258荧光染色，是标记细胞核用的。. H" }5 f" Y% a! k! L
有一点疑问是：阴性对照用的应是纯培养基，怎么会在最后有细胞核呈现黄绿色荧光呢？阳性对照用的是菌株，为什么会有大小不等不规则的荧光着色颗粒呢？

作者: wang2004k2006 时间: 2010-11-24 18:06

阴性对照显色的只有细胞核，呈黄绿色是于所用的荧光显微镜有关，我用国产的显微镜是显黄绿色，奥林巴斯的是显蓝色。阳性菌株中大小不等不规则的荧光着色颗粒就是检测到的支原体，如果污染支原体严重的话就是呈棉花一样的絮状物。

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:13

革兰氏染色
5 `2 b$ X) D* f) x; r( X! S4 t7 t9 ~0 {5 y* a7 S3 |8 U, O
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。% ]3 X* D7 q3 D
, [! T' W$ i4 u" d
方法简介6 [" _" O) V" ~. Q

　　是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram，1853年－1938年）于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。. T% C" P2 E1 _( d9 f/ I
　　未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。/ E0 u" A# z# V0 I+ Q% ~' k: l
　　原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
3 }1 C" i8 D# ^4 |
常见致病菌/ u0 G) l% H' t1 D/ u4 m& ~

　　金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。% V) }0 }7 J* @
　　百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等属革兰氏阴性。
　　所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。) _0 J% F* y+ y1 U/ ?: g3 b

实验方法, m- w0 h) e+ f$ T
8 x0 x2 f& [/ |9 r1 J
步骤1 b: ~( C5 y8 |! @+ [
　　革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
　　1）涂片固定。
　　2）草酸铵结晶紫染1分钟。
　　3）自来水冲洗。, R$ r( d2 x- p( E" D/ U
　　4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。
　　5）水洗，用吸水纸吸去水分。
　　6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。7 B! h5 t% ?! a1 y* t1 ~* U( S" d
　　7）蕃红梁色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。; G7 B2 v# \& }2 s
原理8 F/ _4 \! a. y  {( @0 `
　　通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
染色结果' U$ t5 Z4 ^9 V
　　革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。

临床意义( X! R; I* I0 U% P1 Z9 V: N

　　其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌 2.选择药物 3.与致病性有关：：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。2 P3 c' B* V, P2 [! x  O/ t

特性3 ?# y$ b( @0 M* @& @% l- E: Y5 Z
, R: |" l: C/ F& s" x5 ]! V# R
　　染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用龙胆紫染色，加碘液媒染后用酒精脱色，再用蕃红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G+）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（G-）。革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、碳疽杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。

鉴定原理4 h: Z# j4 Y6 ]2 V, p) L' q( T2 n( d

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革兰氏染色
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。
% `7 c- R. Q; X; O. ]( c% E" |
实验流程) k3 @1 s% Z( k( |- }# f# X  X& }

　　1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。4 w' k1 Y! _5 U5 w( J
　　2、涂片：
　　液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
　　固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。+ t3 ~  S" S4 r* }; s' d
　　  7 B+ D0 I; R- O2 \, M% }) Q
革兰氏染色
3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
　　4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。- y( E: K) z% _6 N
　　5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
　　6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。: S7 ~) a) z5 k  f7 @
　　7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。8 E8 [; A/ o- X* i; R
　　8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
　　9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。8 S( Q5 A2 U$ u* p9 E' Z9 H
# |! a# I9 Y% X( Y) }- \+ k: s0 H
可能误差

　　在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:18

结晶紫 Crystal violet
别名：甲基青莲；甲紫；Hexamethylpararosaniline chloride; Gentian violet6 V# P H4 Q5 B/ M$ h% a
分子式：C25H30ClN32 R. }5 Y w6 G
相对分子质量：40799; ]1 {, {* m( e0 a# Y
性状:具有金属光泽的暗绿色结晶形粉末。熔点为215℃（分解）。溶于水、乙醇和三氯甲烷，溶液呈紫色。不熔于乙醚。浓酸中呈黄色，当pH值增大时其颜色变化是黄→绿→蓝→紫。与Sn4＋、Tl3＋、Au3＋和Sb3＋的卤络阴离子及MoO 、ReO 等形成缔合物，能被苯、甲苯等有机溶剂萃取。在溴蒸气存在下，试剂与类脂质产生蓝色物质（黄色背景）。9 y& @1 [9 ]/ X1 k! L& p
用途：用作酸碱指示剂，pH值0.15（黄）～0.32（绿），pH值1.0（绿）～1.5（蓝），pH值2.0（蓝）～3.0（紫）。用于非水滴定。还用于光度法测定硼、锑、铼、铊、钽、金、钨、锌、镉、汞等的离子缔合剂。并用作生物染色剂及用作薄层色谱法测定脂质的试剂。

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:25

过氧化物酶染色3 i& C( H/ s+ G$ \4 u
peroxidase ,(POX)

原理：( [5 f) \( A  Z! k$ V  }) j7 T. ^( b5 q$ l
5 J6 N# ^! o% O% w% Q
在血液和骨髓细胞中，粒细胞系和单核细胞系的嗜苯氨蓝颗粒 ("A"颗粒)内的溶酶体中存在有过氧化物酶（POX）。通过此酶氧化过氧化氢，释放出单原子氧，后者氧化3-3二氨基联苯胺，使之变成棕黑色颗粒状沉淀物，定位于酶活力所在处。由于各种细胞内过氧化物酶（POX）的活力不同，其颗粒大小与色泽深浅也有所不等。此酶的活性与溶酶体的数量有关，而与嗜苯氨蓝颗粒（"A"）颗粒的多少无关。淋巴细胞质嗜苯氨蓝颗粒中不存在溶酶体，所以过氧化物酶染色呈阴性反应，正常人群中性粒细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞呈阳性反应。淋巴细胞、巨核细胞、红细胞、浆细胞等均呈阴性反应。) k% ^# w+ y! D  h! b& |& [

正常细胞反应:& L0 Q% i: \1 P
' H, W2 {# R6 @9 t
1. 粒细胞系---各阶段中性粒细胞（少数原粒除外）可呈颗粒状阳性或强阳性。定位于胞质内。嗜酸性粒细胞可呈均匀粗大颗粒状阳性。定位于胞质内。8 F' N- c5 D7 j4 R' T

2. 单核细胞系-成熟单核和幼稚单核及部分原始单核(分化较好)可呈弥散细颗粒状阳性, 定位于胞质内。) D/ [5 x+ w2 }" v' \

3. 红细胞系、淋巴细胞系、巨核细胞系、浆细胞系---均呈阴性。
+ ~2 U! r; q! e( s& v
病理变化：

1.酶活性增高可见于再生障碍性贫血、急性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、放射病、嗜碱粒细胞在慢性粒细胞性白血病时可出现阳性。
% J# [; r5 s5 r. f
2. 酶活性减低可见于某些肿瘤、MDS、链球菌感染、风湿热等。  h- n( L; U; `4 n) E1 r9 [

3. 酶活性缺乏可见于：. c  U( T# }2 c0 M: m1 J

a.(MPO)髓过氧化物酶缺乏引起中性粒细胞和单核细胞POX呈阴性,仅在涂片中见少数早幼粒细胞呈弱阳性反应。7 _5 M8 M! \1 I+ S7 O

b.乳过氧化物酶缺乏引起的嗜酸粒细胞POX呈阴性。
  y! C4 ?; a, ~/ t$ E
临床评价:2 N. g, ?; o" }) c: w( T5 E) j

1. 通常将其染色阳性率3%作为淋与非淋的分界标准。但需注意在淋巴细胞白血病时原始粒和单核细胞有时也会超过3%, 此时应慎重考虑, 结合形态反复观察。

2. 若POX染色阳性且强度较高可结合细胞化学染色、细胞免疫表型检测, 遗传学和分子生物学检测对各种急性髓性白血病进行分型或亚型间的区别, 特别有助于M1与M5a、M2b与M3b及M4型亚型的鉴别。+ S1 [: Y2 l: W* o2 v$ ?" `# j0 h
! Q  M$ `( i0 ~) _5 P& ^1 R
3. 若POX染色呈阴性反应, 必须结合其它细胞化学染色、细胞免疫表型, 遗传学和分子生物学, 来加以区分出淋巴系、非淋巴系、双表型、干细胞型等恶性增生。并对Mo与L3、M5a与L2、干细胞白血病与L3等进行诊断及鉴别诊断。, ^' D3 A, p" a# z) v
9 W7 i. d& h; t9 h+ {2 f4 H
操作步骤:0 b1 \* g/ u- V. `" K' y1 E

将新鲜涂片滴加POXI液数滴（覆盖血膜为宜），室温放置1分钟，勿冲洗即滴加POXII液数滴(与Ⅰ液等量)，可用洗耳球轻轻将二液充分混匀后置室温5分钟，随后用流水冲洗3～5分钟。再滴加95%乙醇脱色约2～3分钟，至涂片呈淡红色。水洗后以瑞氏染色液复染10～15分钟，水洗待涂片干燥后镜检并观察结果。) f, t, \  Q3 w! F# S3 l1 v

结果显示：3 ?# x7 ]# K0 r+ \' q, Z

阴性 —（﹣）胞质内无色。

阳性 —（+）胞质中见棕黑色颗粒，呈局灶性分布。2 P2 F3 Y: y/ _% Y6 a
& X; t, y) J# P' o/ e* U
（++）胞质中见粗大、密集、分布较广的蓝黑色颗粒。

（+++）胞质中几乎布满大量粗大、成团块、蓝黑色颗粒。
" v6 k3 m, l! O! T! E5 I+ N+ t2 r7 |
（++++）胞质中充满粗大团块状蓝黑色颗粒并可覆盖于胞核上。位于胞质。

注意事项:! G2 Y" ^$ V- T( z4 T# [! F& u( j
/ I+ _/ f$ L' v8 f1 ]
1. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。, ~" r. ]  ?8 ?2 u  J" O7 j& }
7 W! A6 C. K' f5 {1 o
2. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。+ T1 w: [9 V! f6 e
. k; z4 u2 r. l1 W" W
常见问题与解决方法：
' l% d7 k8 |8 N; d5 K7 G
常见问题
原因
解决方法5 S) |3 _( E9 g/ D7 o' M' j
未见阳性或阳性减弱：3 b7 f+ `8 L* f" H6 d
试剂盒过期太久    从新购买试剂盒' L* T7 i1 }& M
载玻片未洗净标本被污染    取干净玻片从新采集标本4 o5 @. Y: v; [$ `
标本放置时间过久    从新采集标本% W) J/ {+ g; K% X( Y& X
标本沾遇其他化学物质特别是甲醇、过碘酸、盐酸等    采用未被污染的标本重新染色; w) v  m$ X) J5 L, |
试剂滴加量太少或滴加后沿载玻片边沿流失可重新滴加试剂) G; }; ^! F, z0 z
试剂启用后保存不当特别是Ⅱ液    换新试剂或Ⅱ液
使用了加有抗凝剂的标本    从新采集标本

染色背景太复杂：% ]. @8 e9 `. i3 I- n6 Y3 s, s
采用了溶血的标本    采用未溶血的标本重新染色/ {9 G3 {! D% ~% ^
推制标本时用力过猛造成细胞破裂    从新采集标本1 H, |, i. {/ y" X; m
部分白血病细胞易破碎特别是M3型白血病细胞无法去除) J/ K- m2 i8 Q# X
染色及复染后水洗时间不够或冲洗    通常水洗时间为2～3分钟而且- M' \9 P8 ]" i& B$ g) @
方法不当不能先倒掉复染液，须连染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:28

中性粒细胞碱性磷酸酶染色5 `( H; U" \0 s" F$ {( D; m4 w5 E
Neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP)4 w8 h/ K$ A) H7 W" o9 u

原理：  r) {4 I: J2 S  [5 V( B
; W9 r9 l4 \6 Y3 b- i% W, [1 d" a% C
中性粒细胞内的碱性磷酸酶（NAP）在碱性环境下，水解α-磷酸萘酚钠，1 R( v) T2 i0 `3 B. x) q

产生α-萘酚。后者与重氮剂偶联形成红色沉淀物，沉淀物的显色深浅与NAP活性成正比。; x6 t/ D8 k8 q4 r* Q  A) W6 O6 x

正常血细胞反应 :

中性粒细胞碱性磷酸酶是中性粒细胞中的特异性颗粒 ("S" 颗粒 )所释放的一种酶, 存在于细胞质内的三级颗粒中呈不规则形的管状结构, 该酶的活力与积分受到体内许多因素的影响。如中性粒细胞的成熟程度、HbF、内分泌功能等均能使NAP的积分产生一定的差异,但正常人群中性粒细胞的阳性程度一般很少达到3分, 绝对达不到4分。其酶活力的正常范围通常为：# y6 ]. |+ T2 |5 w
" _' c" E) R% d- N; w$ |9 q
细胞阳性率；2～56个/100个成熟中性粒细胞；
! b( I/ C; s& {0 t( e2 M1 d
阳性细胞积分：4～80个/100个中性粒细胞# x+ p5 @! E! E
; i: |; T$ x, b' b! u$ b5 B
病理变化：. ~9 `- i; s) T2 M9 q8 E

NAP 积分增高：" Z8 S2 S, n) Z' F

1. 细菌感染,凡革兰阳性球菌感染、NAP活力显著升高。
$ K& p6 I* o% R  G" \0 O! ~
2. 真性红细胞增多症,NAP活力持续增加,且治疗后未见能恢复正常。* v8 Y7 v! m2 \7 c/ n. M' M
. I6 P& J* I# n7 f: D% j+ |9 k' H
3. 再生障碍性贫血,NAP活力持续增加,经治疗缓解时可有下降趋势。/ b* B$ R3 m# x; n3 l+ L

4. 类白血病,由化浓性球菌引起的类白反应,NAP活力明显升高。
7 Q' s0 G* U% W" n
5. 急性淋巴细胞性白血病可见NAP中度增加,而多发性骨髓瘤则活力显著提高。' C8 Y' ]; N0 y. {! W1 ^2 j
3 d  R; l: Y/ D9 R% I4 U
6. 其它类型如烧伤、中毒、手术后、外伤等均可使NAP活力升高。6 y5 Y( }, h8 {6 j3 J

NAP 积分降低：
; I+ x2 Z; I, d- R
1. 粒细胞缺乏症、脾亢等疾病时NAP活力下降。

2. 感染, 由革兰阴性杆菌、结核、病毒、立克次体病等NAP活力可明显或重度减低。9 i- F" B8 _) s6 D  x; j; Y

3. 白血病,单核细胞和粒细胞系统白血病,特别是慢性粒细胞白血病 NAP活力1 O3 R) O& e6 J" n9 h0 A1 L
. y- k0 y7 R3 ]& g7 C( U+ x
明显减低甚至消失。( A9 Q0 c. i; y% d5 s$ r: j& m

临床评价:
' {4 x* u2 R1 y2 V8 ^' D0 q8 _7 T
若配合染色体检查及分子生物学诊断技术可提高慢性粒细胞白血病的诊断；配合酸溶血试验,尿含铁血黄素试验可提高PNH的诊断及有利于PNH与再生障碍性贫血的鉴别；配合其它细胞化学染色可辅助鉴别急性淋巴细胞性白血病与急性非淋巴细胞性白血病。

操作步骤：

将新鲜涂片滴加固定液（4℃）30秒，水洗待干备用。将NAPⅠ液置入NAPⅡ液混合成为基质液(可先吸取少量NAPⅡ液置入NAPⅠ液内，待NAPⅠ液充分溶解后再一起置入NAPⅡ液内)。将涂片置入后，37℃放置30分钟。连染色缸流水冲洗数分钟，取出待干。苏木素复染1～2分钟，水洗，待干，镜检。

结果显示：9 j6 f6 v, b0 F; D& g
# U! D) T+ M/ O& E9 u2 e: w, R7 w
阴性 —（﹣）0分：胞质内无色。3 }. E& l8 q' y4 g/ }

阳性 —（+）1分：胞质见浅红色，无颗粒或有少量细小颗粒但小于胞质1/4面积。

（++）2分：胞质见红色，有较粗红色颗粒但小于胞质1/2面积。
1 k1 ^& ~6 l) C7 X' j9 h
（+++） 3分：胞质见粗大红色颗粒，可达胞质面积3/4以上。
/ `1 [+ `0 A( @1 p
（++++）4分：胞质见粗大深红色颗粒，达胞质全部面积甚至可掩盖于胞核上。4 m3 g1 ~: e  T

注意事项:

1. 年龄变化：新生儿NAP活性较高,以后逐渐下降。. t2 D, p& O8 o- h9 q' O5 b2 [

2. 应激状态：紧张、恐惧、激烈运动等NAP积分可增高。0 ?$ r1 D" S2 Z  b! F  d% Q

3. 妊娠和月经周期的变化也可使NAP的活力有所差异。

4.药物所致,特别是激素类如肾上腺皮质激素、雌激素等均可使NAP积分增高。( p8 A& R* p7 i# e+ i
. X* K7 m: K% A& k
5. 每次实验均设阴、阳性标本对照。

6. 实验室操作人员最好相对稳定，尽量减少室内误差。

7. 观察结果时需注意涂片的部位, 最好选择体尾交接处,有时不同部位其阳  k3 C  t1 x2 |5 G3 t

性强度可相差二个(+)以上。尤其作慢粒随访病人积分计算时需特别注意。$ q* X) _4 Q( a5 `7 Q2 a

常见问题与结局方法：' e, U8 {  L! X% D- d- Q# W, c

常见问题0 }' H; D1 [) l) W
原因" U7 m" }9 Z7 i$ B4 c
解决方法
未见阳性或阳性减弱：1 L! g. d3 d2 g
试剂盒过期太久    从新购买试剂盒
载玻片未洗净标本被污染    取干净玻片从新采集标本5 E, D6 m: K/ ~/ Z& D
标本放置时间过久且未固定
从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕$ Z. y* a1 ^/ l8 ?2 Y  o; Y6 P
  E8 c+ }1 K% T
固定液使用时大于4℃    另取标本重新用4℃固定液固定
采用了加有抗凝剂的标本    从新采集标本: f) K) J9 q2 x" g3 M  f, J/ M
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等    采用未被污染的标本重新染色8 x7 v9 R2 j( @  ~
试剂配制时Ⅰ液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解    需取新试剂从新配制$ c3 F- ~- z& H! d
试剂配制后未及时使用    需取新试剂从新配制
孵育时间或温度不够    调整温度或孵育时间
: x; a- s# h6 c( `1 A
染色背景太复杂：
背景细胞染色过深孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色  Y7 ~# K- p6 i7 g" L: S
染色后冲洗方法不当
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟

复染后水洗时间不够复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:30

细胞内酸性磷酸酶染色
; b' a) ]9 f* L2 gacid phosphatase in cells ,(ACP)
7 r$ V: \  G  v7 u
原理:( T$ b" o1 W( h/ U1 E, R2 K, X
! I/ H$ u' r8 C0 K1 X
酸性磷酸酶广泛存在于人体组织细胞内, 其最适pH为4.5～5.5左右 , 酸性磷酸酶通常存在于溶酶体内, 其同工酶有七种。血细胞内的酸性磷酸酶（ACP）能水解磷酸萘酚AS-BI，释放出萘酚AS-BI，后者与偶氮剂偶联形成红色沉淀物。沉淀物的显色深浅与ACP活性成正比。

正常血细胞反应 :6 `  Q! o0 R; f$ P$ K
0 _9 v+ I) {& u- Q7 L! O; N6 T6 S
粒细胞系-----部分成熟粒细胞可呈弥散状弱阳性, 定位于胞质内。
淋巴细胞系-- ①部分T-淋巴细胞可呈粗颗粒或小块状阳性,定位于胞质内。# p! Z( k, X9 M
②部分B-淋巴细胞可呈细颗粒或弥散状阳性,定位于胞质内。
2 |2 W$ M0 y( f$ }
单核细胞系---部分单核细胞可呈弥散状弱阳性,定位于胞质内。  `' `4 S6 q; Q# U
巨核细胞系---巨核细胞和血小板可呈弥散状弱阳性, 定位于胞质内。. I9 O2 L* H1 I/ T; |
网状细胞、吞噬细胞、组织噬碱性细胞可呈弥散和/或颗粒状阳性,定位于胞质内。3 u  n* y, Z- W( P4 J0 f
红细胞系----基本呈阴性.
病理变化:3 h( ^6 K( m0 D- J6 X

酸性磷酸酶在T-淋巴细胞异常增多时都具较强的活性, 特别在急性T-淋巴细胞白血病时最为显著, 但对L(+) 酒石酸敏感受其抑制, 在B- 淋巴细胞异常增生时, 多数为阴性或弱阳性反应。而多毛细胞性白血病可呈较强的阳性反应, 且因含独特的同工酶5,不被 L(+) 酒石酸所抑制。所以酸性磷酸酶对多毛细胞白血病的诊断具重要价值。& C& f: f( H* G- {% v8 I
) f0 U) R  z6 V* ~7 J) b
在急性非淋巴细胞白血病中, 单核细胞系统反应比粒系细胞系统较强。多发性骨髓瘤细胞、浆细胞均可呈强阳性反应。另对高-雪细胞和尼曼-匹克细胞的鉴别有较重要价，通常高-雪细胞呈强阳性反应而尼曼-匹克细胞呈阴性反气应。  H2 W! e& h! e, S- m0 J
6 W& q5 T# x: l9 K
临床评价 :% I1 X' _2 X, D  }

1. 结合电镜超微结构检查, 可对多毛细胞性白血病作出诊断。/ T! O6 b% _$ }, ^+ h; r) p

2. 结合细胞免疫表型检测, 有助于区别各种B-细胞克隆增生性疾病 , 如慢淋与毛白、B-ALL与毛白。
+ g6 [# |2 [! W0 U6 m; ?2 C
3. 结合其它细胞化学染色,有助于对急性粒-单细胞白血病亚型的分类。3 @, c7 n$ G! p; }
! e! j& F7 g3 B) i' ~
操作步骤:

将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗备用。将ACPⅠ液、Ⅱ液加入ACPⅢ液中混匀(可先吸取少量ACPⅢ液分别置入ACPⅠ、Ⅱ液内，待ACPⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入ACPⅢ液内)成为基质液。再将涂片置入后，37℃放置90分钟，流水冲洗数分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检。
5 X5 X; ]7 z6 k
结果显示：. t, W0 `9 L( {- s

阴性 —（–）胞质无沉淀物（无色）
* ]' ]) \# e& I4 Q1 M) n; ]' Z; d
阳性 —（+）胞质见浅红色或有少量细小颗粒。' I- B7 S& t2 q. N& I( D

（++）胞质见红色或有较粗红色颗粒但小于胞质1/2面积。) k( ?+ _, I5 R$ L: D

（+++）胞质见粗大红色颗粒，可达胞质面积3/4以上。, n* Y, u9 H# g1 {+ Y

（++++）胞质见粗大深红色颗粒，达胞质全部面积。

注意事项:  q( ]" j+ R4 l: V5 O2 d4 q

1. 由于含酸性磷酸酶的血液细胞有许多, 且各种细胞所含ACP同工酶不同, 即同一基质可有阳性程度的差异, 在同一类细胞中可因基质不同而使阳性结果存在明显差异, 特别在不同的实验室之间龙为突出。

2. 在每次操作时均应设正常标本阴、阳性对照。
- t" y  ^2 \8 M) ]
3. ACP染色结果以弥散状阳性出现的细胞较多,如为弱阳性反应, 在复染时应注意在涂片纵向复染一半, 另一半不复染以利弱阳性的观察。

4. 实验室操作人员最好相对稳定，尽量减少室内误差。
% j$ @. n1 ?5 |7 ]
5. 观察结果时需注意涂片的部位,最好选择体尾交接处,有时不同部位其阳性强度可相差二个(+)以上。作L-酒石酸抑制实验时需特别注意。+ U0 ^3 V( P: N" y# @$ U6 A' f+ h' n

常见问题与解决方法：
1 r! M+ O+ i: k2 H$ H) g" C
常见问题9 {5 @- o! ~1 ]" N4 V
原因4 A. o; T+ W, i3 O; V
解决方法$ Y3 j0 Y0 V# z0 S# C
未见阳性或阳性减弱：
试剂盒过期太久    从新购买试剂盒, l( K! T% X9 |& |/ _6 z! D/ X
载玻片未洗净标本被污染    取干净玻片从新采集标本& s% E" T- [! l
标本放置时间过久且未固定
从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕$ s0 U/ C( t% q& K- j

固定液使用时大于4℃    另取标本重新用4℃固定液固定
采用了加有抗凝剂的标本    从新采集标本  _8 j& S, D1 P$ k2 O) f* u7 U0 m
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等    采用未被污染的标本重新染色
试剂配制时Ⅰ 、Ⅱ 液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解    需取新试剂从新配制; g* O3 O  p- y& [3 Z5 @7 e8 R
试剂配制后未及时使用    需取新试剂从新配制0 F8 v9 U& {& t1 E: s
孵育时间或温度不够    调整温度或孵育时间

染色背景太复杂：, o: g: M" z; q$ n& Q6 b" P
背景细胞染色过深孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色, `. f9 ~$ o: t9 i. z  r1 r
染色后冲洗方法不当 + |: I( c( j% h; G& N& B0 P5 g
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟
复染后水洗时间不够复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:32

氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色' G) p5 m( u- _) Y" G- ^* \5 z
naphthol-AS-D,chloracetate esterase(AS-DNCE)7 A' ?4 v. d4 ?
4 ]! {& u% `: m* C2 r$ l4 `$ o, H
原理:! X0 K- g( c0 q2 S3 a

一般认为, 氯化醋酸萘酚酯酶是粒细胞及肥大细胞的标志酶, 其主要存在于粒细胞(包括分化较好的原粒细胞)的溶酶体上, 此酶与过氧化物酶在中性粒细胞中均呈阳性反应，但此酶形成的产物比 POX 更为特异。血细胞内的氯化醋酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)将氯化醋酸AS-D萘酚水解 ,产生萘酚AS-D，后者与重氮剂偶联形成红色沉淀物。沉淀物的显色深浅与AS-DNCE活性成正比。2 ~7 H# P' w8 q) T- ~9 Q
% H: O9 O& {6 }, e" O' c: S
正常细胞反应 :: f0 W1 h: a6 ?8 M5 L3 ~( l& G
# s  T! U- B+ c" n( v
粒细胞系---中性粒细胞(除原粒细胞外)均可呈阳性或强阳性,且酶活性并不随细胞成熟而增强，定位于胞浆内。嗜酸和嗜碱粒细胞为阴性和弱阳性，定位于胞质内。
2. 肥大细胞有时可呈阳性反应，定位于胞质内。! i* l8 ]$ @( B" d
1 A% X3 a7 X% [% ^
3. 红细胞系、淋巴细胞系、单核细胞系、巨核细胞系、浆细胞系均呈阴性。
/ L0 k2 E0 h6 K. E2 d2 T
临床评价:

1. 氯化醋酸萘酚酯酶亦称为粒系细胞特异性酯酶, 如与细胞免疫表型检测相结合, 对AML分型具有很大的价值,特别是结合CD13、CD33、MPO 等单克隆检测结果, 对AML-M0的诊断有极大的帮助。* |2 A1 _1 Y9 w9 X
& f2 u& q* T/ ~4 m  H8 F9 K9 A
2. 如将氯化醋酸萘酚酯酶染色与α-丁酸萘酚酯酶染色在同一标本进行双脂染色、其对AML- M4亚型分析非常有价值。因氯化醋酸萘酚酯酶仅为粒细胞阳性, 而α-丁酸萘酚酯酶可视作单核-巨噬细胞系统的标志酶。0 I/ `7 Z( q( X+ a5 y) E+ E5 O

操作步骤：
! w4 E6 @- |3 F: S2 c
将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将AS-DNCEⅠ液和Ⅱ液置入AS-DNCEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量AS-DNCEⅢ液分别置入AS-DNCEⅠ、Ⅱ液内，待AS-DNCEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入AS-DNCEⅢ液内)成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检。4 ]* o' R" S/ D3 }! I
6 x8 n. F+ V- ^4 I
结果显示：
2 ^; {6 ~- `: Q
阴性 —（–）胞质无沉淀物（无色）  x. m, g3 h" n0 B/ V) ~
, S( i( E  z7 t" m+ x
阳性 —（+）胞质见淡红色，无颗粒或有少量细小颗粒。
' Z) u1 @, d' m" n4 ^
（++）胞质见鲜红色，有较粗红色颗粒但小于胞质1/2面积。- a4 d& ^+ N0 q

（+++）胞质见粗大深红色颗粒，可达胞质面积3/4以上。& ]5 c4 n' g# d
- I; n( j7 ~0 T  J6 E0 c
（++++）胞质见粗大红紫色颗粒，达胞质全部面积甚至可掩盖于胞核上。5 M3 n8 c9 o4 z/ K$ P
' `7 M2 j% e! L% {& c
3 m4 i# h7 s. w7 X5 q& A
' w' k: l' W( R. x  m* t
注意事项:
2 P* `7 s! W% M5 @  S9 ~
1.此酶主要以定性为主，而阳性强度仅作为参考。因为酶的活力并不随细胞成熟而增加。
3 S: v* Y2 m$ C6 n! S+ }
2.标本必须新鲜, 取材后如无法及时染色可先行固定。
( i/ ^7 j) N0 L8 k6 r8 d
3.每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。
" [1 F/ S  K* \. j- l' a/ F+ M+ W
4. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。) t6 e% D4 P  P
, \% W) c' \' e4 t! r! u& H$ w
5. 氯化醋酸萘酚酯酶染色与α-丁酸萘酚酯酶染色在同一标本进行双脂染色
+ w% O9 L" ^! ?# I" V3 m% u
须向公司另购双酯酶染色专用试剂,用常规染色试剂无法分别阳性结果。0 E! M0 c- a4 {- q
4 M% A3 I3 s8 y, _$ t/ W  U. y
常见问题与解决方法：
. K/ a2 Z! Y- Y1 ]/ t
常见问题- J, v1 }) x: H$ m; W; ?4 N( a/ H: b4 z
原因* y6 v, q" A: S5 J$ g" J' u' _
解决方法
未见阳性或阳性减弱：
试剂盒过期太久    从新购买试剂盒
载玻片未洗净标本被污染    取干净玻片从新采集标本( x! v+ m0 \" C6 F" ]. k& J3 B5 D! L
标本放置时间过久且未固定
从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕
" a3 B6 n' o3 C4 o$ V$ o
固定液使用时大于4℃    另取标本重新用4℃固定液固定
采用了加有抗凝剂的标本    从新采集标本, o. L* V% X0 m" a2 R) A  ^
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等    采用未被污染的标本重新染色
试剂配制时Ⅰ 、Ⅱ 液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解    需取新试剂从新配制
试剂配制后未及时使用    需取新试剂从新配制$ E3 e( ^" i# H# c3 j6 k
孵育时间或温度不够    调整温度或孵育时间9 f( i: g, C0 z/ t

染色背景太复杂：
背景细胞染色过深孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色5 `2 p: f* F% ~9 ?" V' _5 A
染色后冲洗方法不当 " U# ^) [# C4 j% u* n3 g$ x
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟
复染后水洗时间不够复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:35

α-醋酸荼酚酯酶染色$ }9 z4 v- a" |3 a! _
(α-naphthol acetate esterase,α-NAE)、

原理：
$ A: p: a' W/ {8 Y# v
血细胞内的α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）将基质液中的α-醋酸萘酚酯水解，释放出α-萘酚，后者与重氮盐偶联形成灰黑色沉淀物。沉淀物的显色深浅与α- NAE活性成正比。

正常细胞阳性反应:

1.粒细胞系----少数中晚幼粒可呈弥散状弱阳性, 定位于胞质内。2 {. I6 ?9 j1 Y# ]/ G# Y
& a; X# Z6 y7 S" }$ S. h3 Y
2.单核细胞系--成熟单核和幼稚单核及部分原始单核(分化较好)可呈不同程度阳性, 定位于胞质内。

3.红细胞系-----部分中晚幼红可呈弱阳性，定位于胞质内。- j/ @3 ~7 d  M/ i. C
1 {+ D& E! P, K. b- D5 U
4.巨核细胞系--巨核细胞和血小板可呈弱阳性或阳性，定位于胞质内。4 u" k$ h6 J7 Y: ~" \

5.淋巴细胞系—部分淋巴细胞和浆细胞可呈弱阳性，定位于胞质内。6 g( j. R$ V* ~- _
" P! L4 \1 ?' O) {3 M& b0 H" H
6.吞噬细胞----可呈强阳性, 定位于胞质内。6 R1 n! t* }* g3 D

临床评价：+ b  ]5 K# g# w

1.α-醋酸荼酚酯酶染色属临床上常用的非特异性醋酶染色之一。此酶在单核细胞、吞噬细胞中含量较多且多数受到氟化纳(NaF)抑制；粒细胞、淋巴细胞、部分幼红细胞、巨核细胞和血小板等含量较少。非特异性酯酶由于具有较多的同工酶，且不同种类的细胞内存有的同工酶也不尽相同，所以此类酶除了在单核-巨噬系统反应较强烈以外，其它细胞系统也可呈现出不同程度的阳性，所以对细胞中非特异性酶酶如能组合检测比单一检测更具价值和意义。非特异性酯酶染色的主要意义在于结合细胞形态，结合其他细胞化学染色，为临床急性非淋巴细胞性白血病的分型和亚型确定提供重要的依据。+ a8 H1 K( i# H; I7 S
" \6 o* r9 j% }1 f
2. α-醋酸荼酚酯酶因主要存在于单核细胞中，且为同工酶4、5，而中性粒细胞含有的同工酶为1、2、7、9，由于一定浓度的氟化钠能完全抑制酯酶3、5、6，此特点在对急性髓性白血病中M2、M4、M5等分型和亚型分类有一定参考价值。另由于巨核细胞此酶也可呈阳性反应, 如结合酸性磷酸酶染色(ACP)和免疫表型检测, 可对AML-M7作出诊断。
9 u8 c6 p: H4 m2 `+ N0 c' f& u
3. 非特异性醋酶染色若结合POX染色和PAS染色(双酶染色)来综合判断结果，特别是如能将POX 染色与α-醋酸荼酚酯酶染色联合显示于一张标本片上，这比分别染色效果要更好，对M4的分型尤为突出。
4 f# W- ~7 J9 P9 P3 B- @
4. 将AS-DNCE染色与α-醋酸荼酚酯酶染色同显示于一张标本片上，即双醋染色，可使单核细胞和粒细胞系分辨的更为清楚, 并且能发现在同一个细胞上同时存在二种酯酶呈阳性反应, 称酯酶双表现型细胞，为M4的诊断与分型提供了有力依据。, T2 b9 f* U# K- z. d' |
3 b1 W  L4 |: M0 G% _" h
操作步骤：8 T4 m8 ]* Q3 `# z% h

将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将α-NAEⅠ液和Ⅱ液置入α-NAEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量α-NAEⅢ液分别置入α-NAEⅠ、Ⅱ液内，待α-NAEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入α-NAEⅢ液内)成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检。' x! [1 Z2 ^$ a
0 @9 G& ?9 J3 l1 i. B3 I& `: k3 T; k
·NaF抑制试验:3 b- b4 |5 f* ?& k' _1 B4 g

将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将α-NAEⅠ液和Ⅱ液置入α-NAEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量α-NAEⅢ液分别置入α-NAEⅠ、Ⅱ液内，待α-NAEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入α-NAEⅢ液内)，再加入NaF一瓶（订货时可向公司要求配置）成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检! ^' q/ W+ ?3 n; I% k9 M
: z* @, J  D' A- k) o( y% \
结果显示：
, \4 S- L6 O9 o
阴性 —（﹣）胞质无沉淀物（无色）/ R* ^  O0 n: ?) I3 i: c

阳性 —（+）胞质见浅灰色，无颗粒或有少量细小颗粒。+ E( h* q. x9 M) d$ i5 e
; Y' |! {9 N& O  c+ J- @
（++）胞质见深灰色，有较粗灰黑色颗粒但小于胞质1/2面积。7 y% f3 @: Z" c4 b
4 h7 W* U' M6 y8 M
（+++）胞质见粗大黑色颗粒，可达胞质面积3/4以上。
2 J, e9 i7 b( T7 O( m# J& J
（++++）胞质见粗大深黑色颗粒，达胞质全部面积甚至可掩盖于胞核上。
+ A* z$ |# G. z8 u- r' V
注意事项：8 E$ g; W! O1 W
0 Q& }' a1 Z6 x5 e0 p6 H9 K; i
1. 酶的活性随标本采集后的时间而逐步下降，如无法及时染色，应先固定否则将影响阳性结果。
" f; Y" d, p" _8 \* v% J: f8 d' [
2. 涂片固定时滴加固定液要迅速一次盖满血膜，反复滴加可造成染色背景深浅不一。影响结果观察。
. ]/ }0 L: {9 v, b  v$ Z0 m
3. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。

以防引起背景污染，冲洗困难，特别在冬天，易使涂片表面产生脂质沉淀从而影响结果观察。
5. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。' B: l: K8 {# Z* V; E% X
# o0 ^  `, \& [6 j- L
6. 观察结果时需注意涂片的部位,有时不同部位其阳性强度可相差二个(+)以

上。作NaF抑制率计算时需特别注意

常见问题与解决方法：
9 B; U; i8 [/ Z) f! `* z/ {  e, E
常见问题
原因5 N, N) o" |1 T+ `* e
解决方法
未见阳性或阳性减弱：
试剂盒过期太久    从新购买试剂盒; v  Z4 ^2 ~$ t9 n  T- l, \* Y
载玻片未洗净标本被污染    取干净玻片从新采集标本4 s. R- W* j7 Z8 h) A; W% V7 Q: }+ E
标本放置时间过久且未固定
从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕2 Y) T0 X  P2 M% W
: y4 E  d7 T: b6 e/ T
固定液使用时大于4℃    另取标本重新用4℃固定液固定
采用了加有抗凝剂的标本    从新采集标本
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等    采用未被污染的标本重新染色
试剂配制时Ⅰ 、Ⅱ 液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解    需取新试剂从新配制5 l5 ~7 F5 Z! y7 z/ H. ^3 q
试剂配制后未及时使用    需取新试剂从新配制
孵育时间或温度不够    调整温度或孵育时间

染色背景太复杂：8 Y) i. u: C: t0 ]
背景细胞染色过深孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色
染色后冲洗方法不当 5 h/ x( U+ e, F- y" g- O  I* Z% T6 Z
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟0 D% Z$ m% K: y
复染后水洗时间不够复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:37

α-丁酸萘酚酯酶染色- J1 b6 w& W. T4 A; r
(α-naphthol butyrase esteraseα-NBE)

原理:" _# P  ~2 o$ D. g2 m/ \& p# R9 H

血细胞内的α-丁酸萘酚酯酶（α-NBE）将基质液中的α-丁酸萘酚酯水解，释放出α-萘酚，后者与重氮盐偶联形成棕褐色沉淀物。沉淀物的显色深浅与α-NBE活性成正比。
7 o* {8 m1 v1 X" M
正常细胞阳性反应:" [: e8 p: Z2 `3 t
- U' A6 E/ F2 t& I8 z" E
1.粒细胞系----个别成熟中性粒细胞可呈弥散状弱阳性, 定位于胞质内。7 x+ T; H3 ]4 [8 z0 w

2.单核细胞系--成熟单核和幼稚单核及部分原始单核(分化较好)可呈不同程度阳性或强阳性, 定位于胞质内。4 ]/ z+ b8 K, c/ F( @  w
; N2 d& d# ~: Q
3.吞噬细胞----可呈阳性或强阳性, 定位于胞质内/ C" a: P; y+ }7 a, J) s: [

4.红细胞系、巨核细胞系、淋巴细胞系、浆细胞均呈阴性。

临床评价：

1.α-丁酸荼酚酯酶染色属临床上常用的非特异性醋酶染色之一。此酶在单核-巨噬细胞系统中反应强烈，同时此反应也能被NaF所抑制,而粒细胞、淋巴细胞、部分幼红细胞、巨核细胞和血小板等含量很少。所以α-丁酸荼酚酯酶亦被视作单核-巨噬细胞系统所特有的标志酶。若结合细胞形态和其他细胞化学染色，为临床急性非淋巴细胞性白血病的分型和亚型确定提供重要的依据。( w: T7 k% r5 Q9 @, K6 d+ f

2. α-丁酸荼酚酯酶染色也可结合POX染色来综合判断结果，特别是如能将POX 染色与α-丁酸荼酚酯酶染色联合显示于一张标本片上，这比分别染色效果要更好，对M2、M4、M5的分型尤为突出。
$ [# J+ J' h; {: L$ N
将AS-DNCE染色与α-丁酸荼酚酯酶染色同显示于一张标本片上，即双醋染
色，可使单核细胞和粒细胞系分辨的更为清楚, 并且能发现在同一个细胞上同时存在二种酯酶呈阳性反应, 称酯酶双表现型细胞，为M4的诊断与分型提供了有力依据。

操作步骤:% L. C+ e+ z9 a% x; g: n

将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将α-NBEⅠ液和Ⅱ液置入α-NBEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量α-NBEⅢ液分别置入α-NBEⅠ、Ⅱ液内，待α-NBEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入α-NBEⅢ液内)成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检。9 X, U+ t, F5 D; R. f$ b
  Q: [# ]2 x! M% ]' L, J
·NaF抑制试验:, ]0 U* z, p: P4 h' i9 L4 r
1 d. t5 y6 a5 q5 i' y
将新鲜涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，（4℃）30秒水洗。先将α-NBEⅠ液和Ⅱ液置入α-NBEⅢ液中溶解混和(可先吸取少量α-NBEⅢ液分别置入α-NBEⅠ、Ⅱ液内，待α-NBEⅠ、Ⅱ液充分溶解后再一起置入α-NBEⅢ液内)，再加入NaF一瓶（订货时可向公司要求配置）成为基质液。将涂片置入后，37℃放置30分钟，连缸流水冲洗3～5分钟。苏木素复染1～2分钟，水洗待干，镜检8 y6 G$ s" R# S6 d0 n6 g( \4 I

结果显示：

阴性 —（–）胞质无沉淀物（无色）

阳性 —（+）胞质见淡棕红色，无颗粒或有少量细小颗粒。& x, @3 H4 V( z0 y

（++）胞质见棕红色，有较粗棕红色颗粒但小于胞质1/2面积。
6 y3 e- C8 f- H0 ]& D* m# ^
（+++）胞质见粗大棕红色颗粒，可达胞质面积3/4以上。

（++++）胞质见粗大棕褐色颗粒，达胞质全部面积甚至可掩盖于胞核上。$ z' _4 W& S+ G6 N; N2 Q' ~
4 N' T: L0 h8 N
注意事项：

1. 酶的活性随标本采集后的时间而逐步下降，如无法及时染色，应先固定，否则将影响阳性结果。

2. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。$ L0 u+ s/ y7 z" O0 j3 _/ I
! I* R7 }. i3 t# Z; L! Z) o
3. 此染色冲洗时间需适当延长，特别在冬天，易使涂片表面产生脂质沉淀,引起背景污染影响结果观察。
2 f8 \+ ^( t- G8 ~( H3 S
4. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。2 H  q9 Y, N+ r* d
+ y/ d9 L  g7 o
5. 观察结果时需注意涂片的部位,最好选择体尾交接处,有时不同部位其阳性强度可相差二个(+)以上。作NaF抑制率计算时需特别注意。; e5 R! c! M+ D8 I/ O% d
. \  g" A: m& I( f3 b& a) g
常见问题与解决方法：

常见问题
原因
解决方法
未见阳性或阳性减弱：: Z3 e0 B" J0 ^2 J* n4 _! x
试剂盒过期太久    从新购买试剂盒( T- B. i' b! p* Z0 l
载玻片未洗净标本被污染    取干净玻片从新采集标本" U+ ?7 I* z! n" @) \' u
标本放置时间过久且未固定 " k8 H7 A' L$ i3 Z) e
从新采集标本并立即固定，在三天内检测完毕
+ g/ S  J# T% q
固定液使用时大于4℃    另取标本重新用4℃固定液固定2 M$ x4 l  B+ h0 f
采用了加有抗凝剂的标本    从新采集标本2 E* s3 x" `9 s8 }4 N
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等    采用未被污染的标本重新染色% e& G6 l7 k" M/ b  u1 Y8 W9 M
试剂配制时Ⅰ 、Ⅱ 液未完全置入Ⅱ液内或未完全溶解    需取新试剂从新配制
试剂配制后未及时使用    需取新试剂从新配制
孵育时间或温度不够    调整温度或孵育时间

染色背景太复杂：
背景细胞染色过深孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色# a1 U( z. l1 y! h7 r1 B7 a
染色后冲洗方法不当
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟( I2 p% e* p6 W, W' z, e3 M
复染后水洗时间不够复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:39

过碘酸一雪夫反应) n! F6 q3 J$ |# q: W$ H4 K8 [& U
periodic acid Schiff reaction ,PAS

原理:1 k$ d4 C8 v8 l; h7 V* t
7 I" x( {$ |$ C& ]
血细胞内含乙二醇的糖类物质（PAS）能被过碘酸氧化，形成双醛基类物质。后者与无色品红结合，形成紫红色沉淀物，沉淀物的显色深浅与乙二醇的含量成正比。
. ?8 D7 B( e' p3 P/ z  [  y0 K* d  c
正常细胞反应 :: _" j4 ~& Z2 N* ~" E9 L% U
0 ~; x* z$ y" t  C
1. 粒细胞系-----原粒细胞多呈阴性, 通常随细胞不断成熟阳性反应由弱渐强, 至细胞完全成熟后达到最大强度。其中，中性粒细胞呈胞质内弥散状红色阳性，嗜酸粒细胞S颗粒之间的胞质呈红色阳性，嗜碱粒细胞呈大小不一的颗粒状紫红色阳性。
4 F" B% x6 I7 G7 G1 {
2. 单核细胞系---各阶段部分单核细胞可呈弥散伴细小颗粒状红色阳性。定位于胞质内。
: p  T& {; u/ A# X( @
3. 淋巴细胞系---由于亚群的关系, 可有所不同,T-细胞仅一小部分可呈粗颗粒和小快状阳性，但B-细胞绝大部分呈阳性反应。: C' \' Q' M: d* u1 O  B

4. 红细胞系----红细胞系的各个阶段皆呈阴性反应，偶见少数幼红细胞有较弱的阳性反应。
  B) y3 T: z, H
5. 巨核细胞系-- 巨核细胞和血小板呈弥散性和粗大颗粒状强阳性反应，且随细胞成熟而增强。定位于胞质内。0 `" k  u6 O% q% H
! m) i" J- [. O" K. H" Y1 a* G7 a
6. 其他----浆细胞呈阴性反应, 偶见少数呈较弱阳性。巨噬细胞可呈阳性反应。均定位于胞质内。7 i% j" S$ o7 ]( c! o+ q( H
  U* O1 A4 c9 j6 Z9 |, d4 T8 P
临床评价：) i. F1 u: z% d2 a$ T! j

1. 能被过碘酸一雪夫反应呈阳性的多糖类物质有糖原、粘多糖、糖蛋白、糖脂 , 还包括一些磷脂类物质等, 因此PAS阳性不能简单地就表明有糖原的存在, 只是在对血细胞的组织化学研究中通常习惯于将PAS阳性认同于糖原。
! ^3 v; g8 K: V$ e
2.PAS染色虽然不完全代表糖原,但在血液系统疾病特别在各类型白血病中却有较大的应用价值。

(1) 粒细胞系统: 糖原是保障中性粒细胞吞噬功能的能量来源,所以在急性炎症时PAS染色阳性程度明显增强, 在淋巴系统恶性增生性疾病、真性红细胞增多症、类白血病反应等时亦可增强, 在粒细胞系统恶性增生性疾病如急粒、慢粒等, 其阳性程度可减低。0 M, T: M/ p: p8 F
# t) c+ y: p; ?) n9 K# E0 C0 `
(2) 红细胞系统

AS染色在红细胞疾病中具有较大的使用价值，在大部分红血病、红白血病及部分重型海洋贫血等疾病中可呈强阳性反应, 部分缺铁性贫血、重型海洋贫血、MDS、骨髓硬化症等可见阳性反应。其它类型的贫血如巨幼红细胞性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血等均为阴性反应。
! ~! R/ v0 V# w9 h5 G, G
(3) 巨核细胞和血小板系统: 巨核细胞胞浆中存有糖原和粘多糖两类物质，糖原呈粗大紫红色颗粒或块状，粘多糖呈弥散状红色细颗粒, 二者遍布于整个胞浆之中。此为一般血液细胞所不具有，利用此特点有助于与恶性细胞相鉴别, 并结合电镜PPO染色, 免疫表型检测以确定原始巨核细胞的存在和对M7的诊断。) l! W5 H+ s$ Z0 n& O- W* Q
' {+ W" ^7 ]2 w0 @: ?
(4) 淋巴细胞系统: 淋巴细胞糖原的改变主要体现在不同类型的淋巴细胞克隆性增生疾病之, 其中尤以B-细胞恶性增多改变较为明显，如慢淋、淋巴肉瘤、急性B-细胞白血病等疾病的PAS阳性率和阳性强度可明显提高。而T-细胞恶性病变PAS强度无明显改变,另外，淋巴细胞由于感染引起的增多通常PAS多在正常范围之内。

3.PAS 染色虽不能特异地表示何种病理改变，但结合其它细胞化学染色和细胞免疫表型检测及超微结构检查等,对部分疾病的诊断和鉴别诊断具一定价值, 如MDS、M6与其它类型贫血的鉴别；原淋细胞与原单核细胞、原粒细胞的鉴别 ;M6与M7的鉴别、高-雪细胞与尼曼达克细胞的鉴别、 (Reed-Sternberg) 瑞-斯细胞和巨核细胞的鉴别、骨髓转移性腺癌细胞与白血病细胞的鉴别。

操作步骤:

涂片滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，5分钟，水洗待干。滴加PASⅠ液10分钟(若实验室温度较低可适当延长5～10分钟)，水洗待干。置入PASⅡ液内室温（20～25℃左右为宜）暗处放置30分钟，然后小心取出涂片流水冲洗数分钟。苏木素复染l～2分钟，水洗待干，镜检。

结果显示：# j" m' C5 L! c, v$ F
3 E# P* |2 D; Y! t
阴性 —（–）胞质内无色。
- h: i* \8 g' ?6 O
阳性 —（+）胞质内呈淡红色或有少量细小红色颗粒。4 K/ x" L# M  p( g% }, D7 _
6 B8 c" }" ]3 ^4 z8 ]6 q
（++）胞质呈红色或有10个以上红色颗粒。  R& F0 W" Y; }& G; h

（+++）胞质呈暗红色或有粗大红色颗粒，可出现红色块状。; T+ }8 y2 A2 A2 |) Y7 E; A
# D/ [; A* U# V7 V4 N! K, [: |
（++++）胞质呈紫红色或有粗大红色块状。0 C+ u% i7 Q( j" b& n
  O& k. n+ o) P- ]8 X
注意事项:
# y  m$ y. X( |" ~9 `: F
1.标本除新鲜涂片外, 保存较好未被污染的涂片也可使用。
- H* Z; Y2 x+ E  i- @' c5 g
2.标本和器材应避免被还原基团的物质所污染, 以免出现假阳性。1 x- ^; |" w8 P4 t2 K0 U( [+ Y
) b3 H3 O9 R. K  W
3. 涂片经PASⅠ液氧化水洗后, 必须待涂片彻底干燥后方可置入PASⅡ液中, 以免细胞间隙中的残留水份导致整张涂片呈鲜红色, 影响结果观察。$ _- r  [# z4 x4 @
% m% H  i$ T% A9 P
4. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。9 `, h0 r# G! D$ b+ Y; T
$ z9 g; R5 Y( {8 X, v8 g4 q
5. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。
3 F" `6 p+ v0 X( x
6. 观察结果时需注意涂片的部位,最好选择体尾交接处,有时不同部位其阳性强度可相差二个(+)以上。, k% _7 S+ k0 J; c( K
) S. o' U9 V$ {; ]; X1 R6 J/ e
7. 染色后应及时观察结果, 或用中性树胶封片, 以利长期保存。

常见问题与解决方法：

常见问题" s0 Y3 m0 c+ l3 y
原因
解决方法
未见阳性或阳性减弱：5 e- D4 L( k, H
试剂盒过期    从新购买试剂盒
试剂开封后未盖紧开启新试剂盒! s+ s; Y9 K& u' k
PASⅡ开封后混入杂质或水造成试剂变质返红
开启新试剂盒  u& M. I$ c- l$ T7 v: z: r: p
' r* O; X6 i" [2 |
载玻片未洗净标本被污染    取干净玻片从新采集标本" {' H" _( j# `) p+ B: \
采用了加有抗凝剂的标本从新采集标本) H+ x4 N6 K$ [1 K! p
标本沾遇其他化学物质维生素C、甲醛等采用未被污染的标本重新染色
标本在Ⅰ液内氧化时间不够另取标本和新试剂从新操作% D5 H0 ]+ w6 e6 x
试剂配制后未及时使用需取新试剂从新配制* N9 `1 {4 R* v/ H* L
孵育时间或温度不够调整温度或孵育时间- \4 q% k  w* g+ G6 R* t
2 a3 J- g; ?4 w! B
染色背景太复杂：9 c6 j( L: R) M+ y8 M# q' C
标本在Ⅰ液内氧化水洗后未彻底干透    若影响观察需另取标本重新染色
背景细胞染色过深 - [) C/ b* f) b, ]" g
孵育时间太长，若影响观察需另取标本重新染色
染色后冲洗方法不当    不要连染色缸一起置流水冲3 H* i; R$ a2 h* q
复染后水洗时间不够复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:44

铁染色3 h, T! {- H* M
（Iron stalnlng）

原理：5 Q3 v3 M9 v7 W6 M' ~$ }& A

骨髓中的细胞内外铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁部位。蓝色沉淀颗粒的多少和深浅与细胞内外铁的含量成正比。
+ e/ k+ s1 m2 O& o! l
正常细胞反应 :3 X) `) ]+ W  b0 y5 A4 ?

骨髓铁包括幼红细胞外铁和幼红细胞内铁二部分。" Y- t6 q  ~* Z8 g" b

细胞外铁正常为 ( 十 )～(++)9 i6 b1 T% }6 q8 T
+ Q! Y6 e+ B( ^9 |: r1 e
细胞内铁正常为 19～44%幼红细胞阳性 , Ⅰ型为主，少数Ⅱ型。且无环行铁粒幼3 v' O$ a- K# q8 ], J* C4 x% W
6 e$ z( M  Y. l- n
红细胞及铁粒红细胞。7 I+ L3 Z( i9 m  ?' n% M/ v
, ^( Z+ u9 `% {1 E2 L! d4 t
临床评价 :
0 G  {" m* z8 V* }6 }' Q
1. 骨髓铁包括细胞内铁和细胞外铁。细胞内铁为幼红细胞合成血红蛋白时的利用形式, 而细胞外铁是骨髓以含铁血黄素形式存在的贮存铁。骨髓铁染色可了解骨髓中幼稚红细胞对铁利用的功能和铁原料在机体内的吸收与贮存情况, 但外铁在检测时易受到取材、仪器、试剂等因素的干扰, 就其价值来说不及细胞内铁高。# {/ S. p3 e: \) X: i  k
! J+ U+ P! M  k
2. 细胞内外铁减低或消失, 见于铁原料摄入性降低, 铁吸收功能障碍或铁的丢失和消耗过度, 使幼红细胞血红蛋白合成量减少或障碍, 如临床常见的缺铁性贫血及能引起机体缺铁的相关性疾病,如钩虫病、ITP 等均能使机体中细胞内外铁减, 产生贫血症状, 因此对骨髓铁的检测是诊断缺铁性贫血最重要且较早期的指标之一。; H7 _2 S- F0 {
/ t5 ^8 }" t% q' G! T/ q  Q$ F0 D
3. 细胞内外铁增多性疾病见于机体造血功能障碍, 铁利用和转换能力下降或迟缓及外源性含铁物质的多次输入等。临床常见的有:再生障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血、骨髓增生异常综合征、溶血性贫血、白血病等, 均可引起细胞内外铁的增多。6 f( c7 Y; v# Z0 u% r0 E& J; e) H% Z

4. 如将铁染色与血清铁、总铁结合力等检测综合观察, 可了解机体内铁的动态变化, 机体对铁剂治疗的早期效果, 可了解骨髓代偿造血的能力, 所以我们只要严格控制铁染色操作技术, 抓住取材、涂片、染色等几个重要环节, 对结果严格辨认, 就能使细胞内外铁染色在各种贫血的诊断、鉴别诊断中发挥更大作用。5 j  t- g, U$ h0 a% ^/ a# Z
' C# y; o; u" O# O
操作步骤：

骨髓涂片滴加固定液5～8滴，盖满骨髓膜即可。10分钟水洗待干、备用。将铁染色Ⅱ液缓缓滴入铁染色Ⅰ液内，混匀后放入固定好的骨髓涂片，置入37℃水浴箱内放置60分钟，然后连缸流水冲洗数分钟。核固红复染3～5分钟，水洗待干，镜检。
: O# g& t- [8 O
结果显示：5 u, }& R# [) {

细胞外铁：
9 I; k/ A: N, I) v6 r8 Y
阴性 —（–）细胞外和细胞间隙中无蓝色沉淀物（无色）。
! f' l3 `3 E& F& \5 Y
阳性 —（+）细胞外和细胞间隙中见少数蓝色颗粒。3 _' r# d+ I$ Y# ?0 s& p5 Q/ U- Q
4 _3 B) Z4 Y" s) s
（++）细胞外和细胞间隙中见较多蓝色铁颗粒和铁小珠。　　　
: k0 ~+ n! U- M- _5 \3 m
（+++）细胞外和细胞间隙中见很多蓝色铁颗粒和铁小珠。
* ~; V; k  Z5 E# A. ^8 V. v2 R" u9 W1 i0 P
（++++）细胞外和细胞间隙中见极多蓝色铁颗粒和铁小珠并可见铁小块。

细胞内铁：1 [$ O0 E/ F$ }# x, ^- K) t# N
, A4 H9 M& a' M) k6 B- s" @% q) S
阴性 —（–）细质内无蓝色沉淀物（无色）
9 P! J8 D) t' }) W# [; m
阳性 —（Ⅰ）胞质见1～2个蓝色细小颗粒。  G9 C, P2 w  M$ i% j

（Ⅱ）胞质见2个以上蓝色颗粒。

（Ⅲ）胞质见1～4个蓝色粗大颗粒。
$ w' M( O( T3 N# Y! |! [' E
（Ⅳ）胞质见5个以上蓝色粗大颗粒。3 x' W) Y' b* X& M2 c
3 }! x) B0 I8 h+ y7 Z2 @, t
; X) q& k/ u, u
- s7 p+ H  o8 T$ P2 W! E
注意事项:
% ~# K6 `( w6 g% O) g$ G+ P
1.标本取材要满意。外铁检查要选择含有髓小粒的涂片, 如标本保存得当,陈旧骨髓涂片也可使用。5 v8 Z' c/ c7 H, p9 ?2 z

2. 所用载玻片及相关器皿应经去离子水洗涤(至少为双蒸水), 除去载玻片和器皿上可能存有的污染铁, 此点对外铁检测特别重要。' ]- F, b7 B* w
4 t5 @  }: j8 B0 z0 E
3. 试剂要新鲜配置, 如二者混合后试剂颜色变绿则表示受污染不能使用。

4. 复染时应采用纵向, 一半不复染以利观察细胞外铁, 另一半复染以利观察细胞内铁。在寻找细胞外铁时, 最好能在吞噬细胞体内看到铁颗粒, 其比在细胞外看到铁颗粒更有意义。

5. 通常计算幼红细胞内铁染色积分时以中晚幼红为主, 原红和早幼红不计入百分比内。为使结果准确,应选择不同的区域和部位仔细观察,避免发生遗漏和差错。
0 `( H. S1 e) A' f( |
6. 每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。

7. 实验室操作人员最好相对稳定，可使结果稳定得以减少室内误差。$ a! g+ F+ |2 }* R' F
$ A! l5 U# c3 j! q9 B$ {
8. 观察结果时需注意涂片的部位，最好选择体尾交接处。
6 ?, G2 ?1 B- |% U: B. S" M! a
常见问题与解决方法：

常见问题
原因
解决方法
未见阳性或阳性减弱：- }9 O; `% q: B* H6 s; X2 P
试剂盒过期    从新购买试剂盒
试剂被污染变色    需取新试剂从新配制
载玻片未洗净标本被污染取干净玻片从新采集标本3 I2 y% m, c5 i, l
采用了加有抗凝剂的标本    从新采集标本: Q3 s) q  L0 R7 c
标本沾遇其他化学物质乙醚、二甲苯等    采用未被污染的标本重新染色+ o! ^4 q3 S$ \) r! c
试剂配制时Ⅰ液未完全置入Ⅱ液内 Ⅱ液开启时间过长需取新试剂从新配制' Q$ X4 w1 k  `" m% k5 S- s2 L9 B
试剂配制后未及时使用需取新试剂从新配制
孵育时间或温度不够    调整温度或孵育时间
! J/ H: f7 S& E- p! z: V
染色背景太复杂：
标本被铁污染    采用未溶血的标本重新染色
背景细胞染色过深 0 n* n# l5 X% `
孵育时间太长，若影响观察需另取标本重、新染色/ q, W7 o/ _4 N, V% W; X
染色后冲洗方法不当 9 ?0 N- h9 H. O' @4 U* m& j' t7 }/ Y
不能先倒掉染液，应连染色缸置流水冲洗染液，2～3分钟1 H& y0 b7 ^; e
复染后水洗时间不够复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:46

白血病细胞免疫分型测定& c! n' F! M: U* K: V. T1 }/ z# f! ^
2 _- F  s2 n) O' x
检测原理：

利用细胞膜表面所特有的分化抗原对细胞进行鉴别和分型，将免疫酶标技术运用于普通骨髓(血)涂片。可以达到准确区别各种类型血液细胞的目的。本公司采用目前国际上较为先进的免疫组化二步法，并选择国际上被公认的一线单抗和部分常用二线单抗，运用AP染色技术，只需2-3张普通推制的骨髓(血)涂片即可。该法具有灵敏度高，操作简便，试剂用量较少，结果稳定，重复性好，背景清晰，无需特殊仪器(仅用一台普通光学显微镜)、阳性结果保存时间长（便于会诊），整个操作过程耗时仅需2小时即可获得满意的结果。能基本满足临床上对于各类型急、慢性白血病细胞的免疫分型检测。

在血液和骨髓细胞中有一部分细胞含有非常丰富的内源性过氧化物酶，虽然在操作时可采取一些措施来抑制细胞内过氧化物酶，但这种处理比较粗糙，往往不能完全抑制该细胞内源酶的活性，又可造成部分细胞表面抗原的破坏或丢失。而对血液系统中许多恶性疾病的诊断，通常是检测其细胞表面的分化抗原。再则在血液和骨髓组织中，还存在大量的成熟红细胞。其中的血红蛋白对本法也会产生强烈的干扰，(因血红蛋白具过氧化物酶的功能)，可对被检0 Z; o  u2 r; a+ N: b
& @- {9 T1 K# d" c, H5 X
标本的背景产生难以去除的非特异性染色。从而导致结果难以判断。所以在血液学中的细胞免疫组化染色，应该首选碱性磷酸酶(AP)显色系统。而尽量不采用辣根过氧化酶（HIP）显色系统。. j, F! B1 P' h# U6 i+ u

正常细胞反应:6 _2 V7 u9 F4 W

1. T-淋巴细胞------ CD3、CD5、CD7等标记可部分或全部表达，其他系列标记均不表达。

2. B-淋巴细胞----- CD10、CD19、CD20、HLA-DR等标记可部分或全部表达，其他系列
! ?9 Q2 ]8 J% V9 ^, X( O! Q
标记均不表达。4 I3 `7 O8 _9 t& `. s+ o
+ V% z5 p4 P  T; @& p
3. 髓系细胞-------- CD13、CD14、CD33、CD34、CD68、MPO、HLA-DR等标记可部分* ^; {- I) x& J0 c- ^/ v

或全部表达，其他系列标记均不表达。4 `  y6 e5 W7 h

巨核细胞-------- CD41、HLA-DR、等标记可部分或全部表达，其他系列标记均不表达。* p& S  j9 I. a1 e" k4 L+ y
临床评价 :
7 d* D& |7 [; \8 L9 p
1. 白血病细胞-------若呈CD3、CD5、CD7等部分或全部表达；而其他系列标记均不表达。2 E* n1 Z4 Q. ~2 b, t
* W1 q# w) Z" R7 F
提示：T-细胞性白血病。

2. 白血病细胞-------若呈CD10、CD19、CD20、HLA-DR等部分或全部表达；而其他系列标记均不表达。% \1 j( K% B' D( P5 |' a
9 V, l- S9 F5 [& v# D/ O' s$ ?7 s( r
提示：B-细胞性白血病。

3. 白血病细胞-------若呈CD13、CD14、CD33、CD34、CD68、MPO、HLA-DR等部分或全部表达；其他系列标记均不表达。
/ Q! Y$ ~+ c& {/ f5 P
提示：非淋巴性白血病。

4. 白血病细胞-------若呈CD41、HLA-DR、CD 34等表达；而其他系列标记均不表达。; d1 P) I* d  g, M9 f" ]
5 n1 |3 k- C# y8 H
提示：巨核细胞性白血病。
1 i* n2 o6 f! {! o9 }& ^
白血病细胞-------若出现以上1和3或2和3同时表达；其他系列标记均不表达。# r* _- E9 Q- X" v
提示：双表型白血病。* ?; C, H$ P5 j" D

操作方法:

1．取干燥的骨髓(血)涂片1～2张。根据单抗检测所需数量用利器将骨髓（血）膜划分成若干小块，每小块约5×5mm左右，小块之间隙为2mm左右并用阻水笔分隔，并作相应记号，置纯丙酮内固定5～10分钟后即刻置于洗涤液内浸洗3分钟／次，三次。
) ?/ g3 U2 q/ L1 M# K5 e. e4 E
2．取出涂片，用吸水纸吸干分隔线上之水分，但注意勿使血膜干涸。依次滴加单克隆一抗，湿盒内室温20～25℃放置30分钟，后置洗涤液内浸洗3分钟/次，三次。滴加酶标二抗，湿盒内室温20～25℃放置30分钟，后置洗涤液内浸洗3分钟／次，三次。
7 q( h0 E7 m, V! M1 b' [1 N
3．滴加显色剂湿盒内室温20～25℃放置5～10分钟（可在低倍镜下观察，待阳性结果满意即可），流水冲洗2～3分钟。/ R% N4 A- I0 C/ Y" }
4 b' o, m( z* H2 M6 K. I
4．苏木素复染2～3分钟，流水冲洗3～5分钟。待干后用甘油-明胶封片。镜检。
3 _& P) N! X8 {: J: p
结果显示：; N- S; b- O$ k' l! C) c
3 s; |" o) k' b. Z
阳性表达—— 细胞膜或细胞质可见鲜红色沉淀物，细胞核呈兰色。

阴性表达——细胞膜或细胞质未见红色沉淀物，细胞核呈兰色。
6 T9 y4 E* y& r0 S
注意事项：! _; K- @5 s4 }( c

1．样本应新鲜，但注意须彻底干燥后方能检测（抗凝标本勿用）。通常放置24小时后检测，但样本采集后应在3天内测定完毕。若样本采集后不能及时测定，请勿预先固定和冰箱内保存，否则易使细胞溶解。
# ^8 F2 \+ P( R; Y5 d" ^) Z
2．样本应选用骨髓（血）膜较长和较薄的涂片为佳，若血膜偏厚，易引起脱膜，影响结果观察，甚至无法观察。
0 v- N8 Z0 b* c" V, F0 i8 h4 a
3．划分小块时应选择涂片上细胞分布比较均匀的体部和尾部，尽量避免采用涂片头部因该处血膜较厚不利于结果观察，且容易脱膜。
2 C- \  W7 Y, R2 P* T7 ^& K
4．样本采集后至结果观察完毕前，应避免接触与实验无关的化学物品，特别是苯、二甲苯、醚、乙醇、双氧水等，以免细胞表面的抗原破坏，造成假阴性。
  H# C. T7 n+ F: m  C
5．抗体孵育操作不当，可造成背景吸附及阳性细胞呈局限状产生，使结果产生假阳性和假阴性。所以在整个检测过程中自固定后样本均应保持湿润，尽量避免涂片干燥(但是不要留有较多水分以免抗体被稀释使阳性表达被减弱甚至产生假阴性),直至复染后方能使其干燥，以利封片。

6．滴加单克隆一抗时，格外小心避免小块之间相互混淆，而酶标二抗和显色剂等滴加时无须分开。

7．每次洗涤需用染色缸浸洗而且要保证洗涤时间（3分钟/次）与洗涤次数（3次）

7．苏木素复染后流水冲洗时间可适当延长，以保证胞核被兰化有利于结果观察。
5 R+ `8 z: }9 Y" `3 b. n! Z$ {
8．甘油-明胶封片时可吸取50～80μl封片剂置被检涂片中间，采用24×48mm、厚度为0.13～0.17mm盖玻片，轻轻放下即可，若有气泡可用手轻压盖玻片去除。) {( ]% K, Z" ?4 Y( n* W0 I2 [: Y% p; f
( I1 G% m- ?5 [5 Q( e' s  [( h
9．应选择病理性细胞观察其阳性表达情况，若能同时做一张瑞氏染色涂片，对照观察，可进一步提高结果的可靠性。
" c* y# G1 F1 ]& k/ ]0 i" [- W
10．洗涤液因浓缩倍数较高，常有固体结晶析出，用前置于37℃水浴10min后稀释。

11．每次操作均须取正常标本做阴、阳性同步对照。. c' s5 a: Z. e0 }" A
( D! A/ J; M8 [& q
常见问题与解决方法：$ W' ^- H5 P7 z' q8 y- Q
" t& C! C+ q* j( G5 v* |, m
常见问题1 H$ I/ N4 x6 {: ~% H! t
原因4 f& B7 t8 z( E" S3 D; i% X
解决方法# z2 J3 e! ?5 s9 o' k; u0 ^& q$ V
未见阳性或阳性减弱：1 ]. }& A9 |" l4 g1 }
试剂盒过期或保存不当    从新购买试剂盒5 @+ I2 M) h2 J' j
载玻片未洗净标本被污染取干净玻片从新采集标本- ]( Q8 E! U! B7 n) B; A/ d
标本放置时间超过3天以上    从新采集标本* q: X0 a4 h' C/ Y2 F3 y  M: _' [
采用了加有抗凝剂的标本    从新采集标本; i. w6 \1 c3 D7 b6 ?
标本沾遇其他化学物质甲醇二甲苯、甲醛等    采用未被污染的标本重新染色
血膜上留有较多水分需取新试剂从新配制; X: u1 r) [5 J
每次洗涤时间和次数不够    另取标本和新试剂从新操作, U! n3 V  k" V4 ^; \
现色剂配制后未及时使用另取标本和新试剂从新操作, T" u% k# N2 m& e. _3 d* Y) Y- A
封片前碰到苯类试剂    另取标本和新试剂从新操作* E; z- g# f& c4 d
孵育时间或温度不够调整时间和温度另取标本和新试剂从新操作
# a* h7 z; G8 L0 D$ p0 j( @% ^
染色背景太复杂：# A) U$ q+ L8 [; a
孵育时温度过高(＞350C) 2 }) |4 Z4 ]5 w; P  m  j7 @5 \
若影响观察需另取标本和新试剂重新操作
背景细胞染色过深
显色时放置时间太长，若影响观察需另取标本和新试剂重新操作
各种破碎细胞较多 - ]/ N9 B! G* x
无法去除1 Y9 K' K" X/ U& s; s
显色后冲洗时间不够    保证流水冲洗时间1 T' l6 C( Z; S$ S6 V5 w3 V
复染后水洗时间不够复染后水洗时间通常为3～5分钟而且须连复染液一起冲洗

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:50

版主多加点威望吧，贴得好辛苦哦！

作者: zuming 时间: 2010-11-25 09:59

http://www.med66.com/new/27a381a2010/2010513yuchan105947.shtml0 t8 L) u; ~ O) W
这里有个细胞染色的小总结不错！

作者: zuming 时间: 2010-11-25 10:00

下面是苏丹黑B染色的视频：
http://www.tudou.com/programs/view/P58kK2Pp_wc

作者: zuming 时间: 2010-11-25 10:03

好啊，离50分只差7分了，呵呵！

作者: zuming 时间: 2010-11-25 10:21

石蜡切片免疫组化染色步骤2 e0 S0 X# \0 V: w: w+ p/ k) y8 h
1、载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。/ d$ b2 ~0 P# U7 t5 g% T
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。- w6 |" F) O$ q, ~% n
g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤：（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）8 @4 o' s- E% Q. s( j" y2 ~' j
石蜡切片脱蜡至水。! Z7 c7 [( {  z- a: I( s. f
3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。0 b, P! V( D) c, T; \0 Z
PBS冲洗，5分钟×3次。$ ^1 ]: {4 E, S; ]" {
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。# E0 D6 g" P1 }- J- E+ [
PBS冲洗，5分钟×3次。
显色剂显色（DAB或AEC）。
自来水充分冲洗，复染，封片。0 _  @, ~+ P7 I9 ~) ~
冰冻切片免疫组化染色步骤
m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。冰冻切片4~84 s# F4 A: g& l& Z" E, H
  S$ K- I. j- N' x, Z
免疫组化非特异性染色的消除方法
一、非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 6 \/ w) q) h3 B' d" ~4 u
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。 : k  N* A0 t  d
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 7 c1 O& e5 M, ^: ]8 C6 k
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。二、消除非特异性染色的方法 1 q: S+ x5 Y' k9 f. K% L
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
（一）动物脏器粉末吸收法 & [* e2 L3 f, `1 ^" Z1 H; L/ F( P
常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min , j, }9 N7 D# o6 T& `
10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。 ' y% B* b" Z4 l1 o
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。 8 h5 v, N: V. _" r$ I$ X
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
2006-12-22 13:24 wifgw
二）透析法 3 b/ N- r' [/ k2 [6 V* P
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/pH / J+ N; p+ {8 V+ D6 r& ~: \
7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 . ?9 u" V4 A# n! d" j3 H
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。 " U& q% A" F4 M' {) @6 H
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。 ' n3 M5 E% Q3 l$ P! J
（四）DEAE纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜 6 ~% S6 a* c( t4 V. Z
。常用梯度洗脱法如下： " Z) r* u" q, s# v2 R
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液， * g" f! J% q5 t
分别洗脱和收集： / {# W& {8 b7 @/ l+ G: z% r
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脱部分3。 / R7 s% A0 `3 S0 l( T, E
将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。 - t% M3 i, V$ G9 D/ L
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至
2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法 6 F- g$ {: b; {" O3 S0 b4 O- D9 y
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法 7 Y6 U+ `" g  o+ L8 C% r
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。 3 A. ^& `) I8 \7 J) c1 ?
（七）纯化抗体法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下： 8 u$ D* V5 V, O5 ?) x, R& m
1．人IgG聚合物的制备  在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。 5 T$ z& \& E* G8 _/ z( e1 s
2．免疫吸收法  将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法 + q# b; E; l, |, }( {2 X6 K
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以
和然释荧光抗体。   c8 ^3 u) Y+ x3 ?. a: X
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。

作者: zuming 时间: 2010-11-25 10:24

DAPI染核- O, f: a, k4 b) ?) j- l
原理：" H+ v( Z4 h, z3 N9 k9 @( c
主要结合dsDNA；结合小沟的AT。DAPI也结合RNA，但其发射峰波长（500nm）要长于DAPI/dsDNA（460nm）。
DAPI dilactate更水溶。在用于组织染色、未固定细胞和组织染色时，下述方法可加以修改。  |  e  t; X7 }$ D
保存：! l7 E$ z& h  r, e: G- W! q
10mg/单位，室温避光保存，小瓶内至少一年。制stock液，溶解100uM （DAPI dihydrochloride二盐酸化物分子量为350.3；DAPI dilactate分子量为457.5）DAPI于去离子水中或DMF(二甲基甲酰胺)，4℃避光可保存6个月。
DAPI是诱变剂，水溶液可通过活性炭去除，要安全处理。
染色：, Y7 `/ j* k" _3 W# E
在所有染色完成后进行复染，不需要另外的固定和通透处理。# W% R/ d$ d. i! x6 \0 k
荧光显微镜复染方法：
1.       PBS平衡3 ?# e) W" N% ?; W% B" b  s
2.       PBS稀释DAPI stock液至300nM，滴加300μL这种稀释液于细胞上。
3.       孵育5分钟。: {8 W5 C# ?+ [# X5 D2 |
4.       PBS中涮洗几次，涳干过量缓冲液，抗淬灭剂封片。
FISH复染：. r# I, m- P6 ~7 A  F
样品在dH2O中洗以去除残留缓冲盐溶液，有助于减少玻片上非特异背景。
1.       PBS中稀释至30nM，吸300μL滴于样品上，塑料玻片有助于平均分配染料。
2.       黑暗室温孵育30分钟。
3.       去掉盖玻片，PBS和dH2O中小心盥洗。
4.       去掉过量液体，绵纸在样品边缘小心吸取。
5.       盖上盖玻片，蜡或指甲油封片。或按供应商的指导加抗淬灭剂。
荧光显微镜观察。

作者: zuming 时间: 2010-11-25 10:25

Rhodamine 123 染色' ^" T5 r' C, P: p& t: ~) t
中文名称：罗丹明 1238 e) L3 h0 D* B2 y1 E
目的：测细胞内线粒体的跨膜电位
EX/EM：  505/5341 _) `+ S( J2 y8 U. I7 ?
染液配制：罗丹明123 粉剂用甲醇配制成1mg/ml的储备液，100ul/支分装，-20℃保存。染色时用Dulbecco’s PBS缓冲液将其稀释为5ug/ml。
染色步骤：) d) H# i) e+ P, b
培养细胞  P1 s" I  k0 B* i9 g
2 Q! D" E4 p1 L3 g5 {9 r/ C
Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2～3次(缓冲液预热至室温或37℃) . A9 t  v, w/ r5 u7 S: Y5 r- E

Rhodamine 123(5ug/ml) 37℃孵育1小时

Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗2～3次 : V2 m& @9 G7 r1 |" L- E5 Z; [- L; A
1 e  h: @  G$ ]5 P
加0.5ml Dulbecco’s PBS，上机测量

作者: zuming 时间: 2010-11-25 10:25

Fluo-3-AM 染色 6 e. @$ l8 j% j
(测细胞内游离钙离子浓度), x6 E! H' o# u- e7 {+ O* M
原理：
AM酯的羧酸经修改不带电荷，易浸入细胞。一旦进入细胞，亲脂性集团被非特异酯酶切断，使其带电荷，从而溢出细胞大大减慢。一般，酯化集团水解对于结合靶离子是必须的。AM酯水解显颜色或荧光的特点可用于检查其自发水解。; x4 ?4 n: ?3 A6 T1 O. g6 \6 ?
9 |: G+ O, A# r3 ~2 V8 \" {) L. G% [0 k
保存：
指示剂干燥避光4℃或-20℃可长期保存。0 b) o% m  r/ Z& y$ [4 H
AM酯易水解，发货瓶中至少可放六个月。
用时AM应溶解于无水DMSO，并尽快使用（一周内），否则细胞运载能力下降。AM的DMSO储备液应避光、冷冻、干燥保存。盐的储备液应用蒸馏水或缓冲液制备，冷冻-20℃避光保存，可放6个月。
应用：
用细胞浸透AM酯运载技术：2 C  R/ E3 Y  L* }
1.在生理缓冲媒介中将DMSO稀释至1-5μM。不可用含胺的缓冲液如Tris。
2.有机阴离子转运抑制剂苯甲酸（1－2.5mM）或sulfinpyrazone(0.1-0.25mM)可加入细胞外液以减少指示剂去酯后的渗漏。苯甲酸和sulfinpyrazone是很碱性的，所以之后要重调pH值。
3.AM酯孵育细胞一般在20－37℃，15－60分钟，准确的浓度，时间和温度靠经验摸索。AM酯运载技术有一个内在问题即亚细胞隔阂，降低孵育温度可以减轻这一副作用。
4.检测荧光前，建议细胞最好在无指示剂媒介中（最好有阴离子转运抑制剂）洗，以去掉细胞表面的非特异吸附的染料。而后再孵育30分钟来进一步使细胞内AM酯完全脱掉。荧光素泄漏引起的背景高可以在实验前在细胞外加入抗荧光素抗体来防止。6 p, o+ U& b, J0 O$ U: b. ^  P9 ]. p" v/ ~
目的：测细胞内游离钙离子浓度/ n/ U! C1 h$ W. [! E% p2 @4 ~
EX/EM：探针在细胞外液无荧光，进入细胞后最大激发波长和发射波长为464/526
5 d+ X' _, Y! l+ }$ b5 q. d  z: I0 s
方法一：+ c$ r7 V) J0 Q  \2 k' X; m+ i- e( X1 F
染液配制：Fluo-3-AM 50ug溶于45ul DMSO(Fluo-3-AM浓度 1mM)，15ul/支分装，-20℃保存。染色时用15～50mM HEPES缓冲液将其稀释为1～20uM(如1.5ml 为10uM)。, B8 ~3 E+ B3 ^& u  x3 w
染色步骤：' o4 p( u; C' J1 _+ Z
培养细胞
2 J7 F4 W8 U8 S7 ~
缓冲液漂洗2～3次

Fluo-3-AM (1～20uM) 37℃或室温孵育0.5～1小时" c5 f  x% D3 d- ?# |! c3 _9 b

缓冲液漂洗2～3次 + D3 i6 b0 U( [! N/ D7 r0 h
, x; R+ V6 o" O4 Z) @( G  s
加0.5ml 缓冲液，上机测量

作者: deron 时间: 2010-11-25 10:42

神马情况？不能评分了……

作者: deron 时间: 2010-11-25 10:43

回复 21# zuming ; {. L% N' r1 T

太给力了，zuming兄

作者: zuming 时间: 2010-11-25 10:50

回复 41# deron
能找到的资料就往上贴了

作者: deron 时间: 2010-11-25 10:55

回复 42# zuming

宁缺毋滥，有些格式需要整理

作者: zuming 时间: 2010-11-25 11:01

回复 43# deron & x' d, y8 U, t, | q5 T
对不起，您的帖子从发表到现在已超过 30 分钟，不能再进行编辑，请返回。1 A/ p. J" G& Z) I( }5 g) M
怎么这样啊！哎！

作者: deron 时间: 2010-11-25 18:05

本帖最后由 deron 于 2010-11-25 18:09 编辑 - y, A6 n. s+ p, i

关于伊红(eosin)2 c' h/ F+ ^- B) V( ?

伊红为酸性染料。微生物学实验中，用于鉴别产酸性细菌的一种培养基添加剂；细胞生物学中常用于细胞质和细胞间质的染色——因伊红为酸性染料，易结合嗜酸性的蛋白质（即碱性蛋白质）。8 X' q* _3 h: j6 G+ \. z1 W3 x1 I
# q* \& {0 Y. \. J3 O/ C

伊红分水溶性的和醇溶性0 W" ^9 P7 |7 m2 M6 ?3 M5 }+ D% `

伊红——水溶性" B2 R( ^! d2 G, \& T5 Y

3 [9 {( M! F) g( C1 b& {- s
C20H6Br4Na2O5 ——分子量691.86
性状：红色粉末，易溶于水，溶液呈绿色荧光，能溶于醇。 $ h' ?) U4 t. \2 T" n$ |, ~
用途：组织学用于上皮细胞、肌肉纤维和细胞浆染色。

0 b# [. J& ]2 A$ p
伊红——醇溶性

3 V9 p9 O2 p+ z/ Z5 Q: l
C20H8Br4O5——分子量647.96 F+ s; V. D( d6 z! \4 J9 D4 y* l
性状：红色结晶状粉末，能溶于碱，微溶于乙醇，不溶于水。 * H" f% z6 R6 F5 n
用途：吸附指示剂，检测F离子，定量分析滴定溴离子和碘离子。0 v. i/ }4 g4 M: R: H' X9 G

最简单配方：
伊红（醇溶性）1g ，75%酒精100ml，加几滴冰醋酸至半透明状。
伊红（水溶性）1~2g ，蒸馏水100ml，加入几滴1～2%冰醋酸。

作者: deron 时间: 2010-11-26 15:23

HE染色，这里有一个火热的版本。
很好很全很强大~

成品——HE染色protocol.pdf (243.1 KB)

附件: 成品——HE染色protocol.pdf (2010-11-26 15:23, 243.1 KB) / 下载次数 22
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=MTc1OTh8YzFhYTY4OWR8MTc4ODYwODc1N3ww

作者: deron 时间: 2010-12-1 15:48

最近手头事情太多，专题进展不大~~~
今天把之前大家奉献的染色技术罗列出来，方便大伙儿继续补充——最好是亲自做过，对原理和步骤有大体掌握。
1.台盼蓝染色——————用于细胞凋亡检测——整理者：deron+ J; A" G6 O% U! H+ q0 Q# w
2.Hoechst33342————用于凋亡的染色剂——整理者：yuhaoze
3.考马斯亮蓝——————用于蛋白质染色——整理者：jhu132llh(八卦一下ID名：jhu一生爱llh？)6 E# C, R) L2 K% W$ \4 E5 W( D# ~
苏木精染色——————用于细胞核染色 m0 q9 ~( p( v
4.瑞氏染色———————用于细胞染色，区分核质——整理者：deron
5.碱性磷酸酶（ALP）——用于成骨细胞钙节指示——整理者：lipd09@mails* P7 R# ]) H& {- }
6.吉姆萨染色——————用于细胞染色，区分核质——整理者：deron
7.Hoechst33258————用于细胞核荧光染色——整理者wang2004k20066 ^' ~* s' F( C
8.革兰氏染色、结晶紫、过氧化物酶（POX）、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）、细胞内酸性磷酸酶染色（ACP）、氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色（AS-DNCE）、alpha-醋酸萘酚酯酶染色（alpha-NAE）、alpha-丁酸萘酚酯酶染色（alpha-NBE）、过碘酸-雪夫反应、铁染色、白血病细胞免疫分型测定————大多是检验科室用来检测细菌及细胞类型，来自于医学教育网http://www.med66.com/——整理者：zuming
石蜡切片免疫组化染色、DAPI染色、Rhodamine123染色、Fluo-3-AM染色——整理者：zuming; [% j) J# S. p0 }4 @2 `( |2 A
（zuming童鞋的很多格式转自网上并不规范，第八条的所有技术步骤大家均可以根据自己做过的实验情况重新整理一下）0 S: c6 ^6 }+ u; N2 x
9.H&E染色——————用于细胞染色，区分核质——整理者：deron

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