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标题: 收蛋白样品为什么粘稠？ [打印本页]

作者: hndxws 时间: 2010-11-18 10:25 标题: 收蛋白样品为什么粘稠？

做western收样时，用RIPA裂解细胞后，蛋白总是很粘稠，听说原因是核酸的原因。不想加太多的RIPA，因为要测浓度，所以不能先煮。请教大家一下，该怎么做才能不粘稠？有人试过加DNA水解酶的吗？

作者: 芦苇风 时间: 2010-11-18 11:08

我没用过DNA酶,但我可以说说我的感受。一般来说裂解液都是按细胞/组织量加的，太多了太少了都不好，多了浓度会降低，其中过高的裂解液成分也可能会影响后续的实验；少了会导致裂解不完全。我的感觉是:吸取上清蛋白时，一般是感觉浓稠的用BCA法测浓度较高，反之较低。

作者: hndxws 时间: 2010-11-18 13:02

浓稠的用BCA测的确是偏高的，应该把粘稠的东西使劲吹很多次，变得不是太粘稠了再离心取上清测浓度。主要是吹的太费力费时

作者: 芦苇风 时间: 2010-11-18 16:56

我不是太清楚你所说的粘稠的物质形状如何?感觉那些粘稠状的物质离心后是可与上清分离的,经过吹打后又可以减少,两者可以互溶??. x9 r5 d8 W" b7 l3 w0 b* D
在最后一次高速离心后,培养后刮取细胞提取物一般分2层,上层清亮,取之测浓度;组织研磨后提取物有时会分3层,中层混浊但不粘稠,最上层清亮,但有时量很少,对于这个我的方法是按组织量追加裂解液再次离心提取上清.
BCA法由于其测定原理,反应后颜色过深或过浅都会使计算结果有偏差.' M8 v3 M% r! I: Z! f
我在网上看到的是,如果粘稠物为核酸,可以通过加入DNA酶\增加裂解液的量\裂解前超声裂解细胞将核酸切为小片段.- }1 r" L: r- G) h3 K
如果想看看粘稠物是什么,可否尝试将其分离后用紫外分光光度法测定下其吸收峰?核酸和蛋白吸收峰不同.然后用加入DNA酶和增加裂解液的方法以比较.可能花点时间,但应该很有帮助., P0 A, A$ p; T$ w4 \# Z. B
说了很多,好像不沾边,希望能帮助到楼主.

作者: weiyepan 时间: 2010-12-2 08:12

超声打一打最好，有DNase也可以用，不过我没用过RIPA，不知道对Dnase活性有没有影响

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