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标题: 免疫组化基本步骤 [打印本页]

作者: xiaocuicui 时间: 2010-11-21 18:36 标题: 免疫组化基本步骤

免疫组化

作者: stemcellfamily 时间: 2010-11-21 19:17

1、载玻片的处理：
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。. W' e" _9 G" F% M& q; x. a  c1 o
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：7 y7 G& i' n$ a8 ?& m
2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。9 i, d/ q& i' |, U' P* M8 g
  2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。
3、抗原热修复：
可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0  0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。3 L3 W& ?7 D6 d4 T- P
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。% f# R1 V0 x/ L$ t1 X7 Y* V4 z5 n
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
  3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。. b: }1 d& ^& `4 y5 U; I1 |) x
4、免疫组化染色步骤：' c# b! H$ i8 j% K( z
  （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
石蜡切片脱蜡至水。
3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。; r( p# h9 N$ N% ]3 t1 P
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。0 p, o" q2 D9 H. {8 ]4 P6 _% {
5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
PBS冲洗，5分钟×3次。
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。! s2 y) W) k# u, Y0 C
PBS冲洗，5分钟×3次。
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。/ |4 Z" L" a  D, I5 ~+ [- s6 a
PBS冲洗，5分钟×3次。
显色剂显色（DAB或AEC）。: J* a& d4 F1 }- t
自来水充分冲洗，复染，封片。6 z5 `! V$ C* b" K
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片4~8m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。

作者: seventhcat 时间: 2010-11-22 10:58

受益匪浅，谢谢

作者: xiaocuicui 时间: 2011-2-27 11:07

真的很有帮助

作者: 421087176 时间: 2011-2-27 11:53

谢谢

作者: syl1982 时间: 2011-3-11 17:02

免疫组织化学染色 ( t0 A7 q  ]& y* s3 s
SP法：
脱蜡、水化：
脱蜡前，应将切片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1 ^& U0 N0 f2 K6 o# N, c
切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； / K9 q% ^0 y7 p- W2 e" v; U
无水乙醇中浸泡5分钟； 0 B* P/ i1 G1 h& u
95%乙醇中浸泡5分钟； % U2 f  Z, x# h" q% q. }5 l; Z, K
70%乙醇中浸泡5分钟； $ F, |# n& }$ _: w2 S
PBS洗2～3次各5分钟；
3%H2O2（80%甲醇）滴加在切片上，室温静置10分钟；
PBS洗2～3次各5分钟； + x% V; W/ A  r1 G' L9 c6 d8 x
抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） ' y! H& U; O' }( F8 W9 T/ W
抗原热修复 5 h& ]0 f  \& g; I
高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 ! O6 V. K" e, r9 j( l4 w
煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入切片加热10~15分钟。
微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将切片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 3 Z! E. |5 p( y& h. u8 N! N9 _" R
酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
PBS洗2～3次各5分钟；
滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
滴加一抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 5 x# s$ j; E9 J0 `2 K$ x
4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
PBS洗3次各5分钟；
滴加二抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
二抗中可加入0.05%的tween-20； 7 j7 R5 _0 N& Q! @/ p# ~
PBS洗3次各5分钟； 4 R. e- ~6 o7 [# l/ m, s+ d7 Z& \* N
DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； 7 ]8 \4 J$ x) W, H) h" e
PBS或自来水冲洗10分钟；
苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
自来水冲洗10～15分钟；
脱水、透明、封片、镜检。 / }. @+ P& L3 T6 y" r  w
SABC法: - S# O6 P& v9 w! m  J9 }3 ]6 N
脱蜡、水化；
PBS洗两次各5分钟；
用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次； & z' G' P' X9 s
抗原修复； 6 y; V* e/ h" z2 B' m/ D, S" a
PBS洗5分钟； 2 l( b6 i9 m4 _4 I; f$ y
滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体； 6 X" N: l; X: ^4 Y
滴加一抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）
PBS洗三次每次2分钟； 8 J+ E' T! W$ ^; _) M* [
滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟；
PBC洗3次每次2分钟；
滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟； # A# H( h6 D8 u+ f
PBS洗4次每次5分钟； / [: O6 G0 Y  e1 I' k; m3 z$ L! _- I
DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）；
蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化；
脱水、透明、封片、镜检。 - i, L$ Z' v; |: X2 V% m* l

作者: aulenuyah 时间: 2011-3-11 23:20

谢谢楼主

作者: aulenuyah 时间: 2011-3-11 23:21

和回答的同志们

作者: wstl1986 时间: 2011-4-21 22:25

很有用

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