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标题: 神经干细胞纤维蛋白凝胶支架移植治疗阿尔茨海默病的实验研究* [打印本页]

作者: 文献管理员 时间: 2009-3-3 12:33 标题: 神经干细胞纤维蛋白凝胶支架移植治疗阿尔茨海默病的实验研究*

作者：黄镇，衣昕，田美玲，秦建兵作者单位：南通大学神经生物学研究所，南通 226001



                     1 z$ O  \( F# n- Y



                  3 C: Q( x- m/ t& |+ e5 ?) y, K


      ; ^4 ~. g' @# M* a1 `
      【摘要】  目的：观察神经干细胞纤维蛋白凝胶支架移植治疗阿尔茨海默病（AD）模型的效果以及神经元分化的情况。方法：体外分离培养大鼠胚脑神经干细胞，用纤维蛋白凝胶为支架移植入穹隆海马伞切断AD模型鼠海马，行为学测试后用免疫组织化学方法检测神经干细胞存活和分化情况。结果：支架组动物行为学的改善明显好于单纯干细胞移植组，支架组神经干细胞的存活和分化为神经元的情况均明显好于单纯干细胞移植组。结论：将纤维蛋白凝胶支架应用于神经干细胞的移植能促进干细胞的存活和分化。 . e. `" |: A4 ~* X! L( D0 ?3 G
      【关键词】阿尔茨海默病；神经干细胞；纤维蛋白凝胶支架；移植；大鼠  l& B5 {" g; g5 `% A6 h


Study on treatment AD by transplanting neural stem cells and fibrin glue bracket

HUANG Zhen, YI Xin, TIAN Meiling, et al（Institute of Neuro- biology , Nantong University, Nantong 226001）

[Abstract]Objective: To observe the effect of transplanting neural stem cells and fibrin glue (FG) to treat AD model rats and the differentiation of neurons.Methods: We transplanted neural stem cells from embryobrain of rats in hippocampi of AD model rats transecting fimbria fornix with or without FG. 30 days after transplanting, test these AD models' behavior then inspect living and differentiation of NSCs by immuno -fluorescence.Results: Significant behavior improvement was observed in FG group and single NSCs group, but FG group is better than single NSCs group.The survival and effect of transplanting neural stem cells in FG group is superior than in single NSCs group.Conclusion: FG can improve the survival and effect of transplanting neural stem cells.  B& Y  t) Q0 l% _; a" Z

[Key words]Alzheime’s disease; Neural stem cells； Fibrin glue； Transplanting； Rat
- d( g0 L% R3 C& F; ?& T
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），也称早老性痴呆，是一种以记忆能力减退、认知功能障碍、行为异常为特征的中枢神经系统退行性疾病之一。直至今日仍未能找到有效的治疗AD的方法。神经干细胞研究为这类疾病的治疗开辟了一个新的方向。目前，国内外有关神经干细胞治疗PD的报道非常多并且都获得了较好的疗效[1-3]，而对神经干细胞移植治疗AD的研究报道则较少[4]。直接将细胞注入损伤部位难以使细胞保持良好的生长状态，不利于细胞黏附于受损部位的组织进行分化和增殖，选择适当的细胞支架是移植成功的一个关键因素。纤维蛋白胶(fibrin glue, FG)是一种天然材料,资源丰富,生物相容性好,具有刺激未分化的间充质细胞增殖、促进毛细血管增生和长入的作用。本研究在体外分离培养大鼠胚脑神经干细胞，用纤维蛋白凝胶为支架移植入穹隆海马伞切断AD模型鼠海马，探讨纤维蛋白凝胶为支架移植神经干细胞对AD的治疗作用，为神经干细胞移植治疗AD奠定理论基础。

1材料与方法
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1.1实验动物及试剂Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重220～240 g，雌性，由南通大学实验动物中心提供。DMEM、F12培养基，B27，胎牛血清（Gibco公司）。碱性成纤维细胞生长因子，FG，Hoechst33342，结合FITC的山羊抗小鼠IgG（Sigma公司）。小鼠抗微管相关蛋白-2单克隆抗体（MAP-2）（Chemicon公司）。5 i& t$ O5 [+ w0 B* N- G, Y/ H/ x

1.2方法9 n: H. q1 E( N& b+ m, b  N3 k) H$ a/ B

1.2.1制作AD模型鼠及行为学检测220～240 g SD 大鼠若干只,雌性，麻醉后固定于立体定位仪，暴露前囟,记录前囟坐标A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴）。根据Paxinos 图谱确定右侧穹窿海马伞的切割范围，在颅骨上确定两点即A1=-1.4、L1=-1和A2=-1.4、L2 =-4，将两点间的颅骨划开一条骨缝，针刀插入脑内至切割深度V1.2=5.4，左右来回切割3 次，退出针刀，待无颅内出血后缝合皮肤，肌注青霉素。术后30天起进行避暗回避试验和跳台试验，测试仪器和方法同施碧涛等[5]报道。* ^1 }/ j* N# ]0 \
4 \+ Z9 x7 O! [# @/ b
1.2.2神经干细胞体外分离培养和Hoechst33342标记孕15天的SD大鼠腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent麻醉后，取胚鼠前脑室下带组织剪碎后胰酶消化。用毛细吸管机械吹打均匀，经200目不锈钢筛网过滤，台盼蓝染色计数后接种至培养瓶并添加bFGF，然后置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每6天克隆传代1次。向传至第3代干细胞培养液中加入Hoechst33342，终浓度为5 μg/ml，培养箱中培养1小时后，自然沉淀10分钟，弃上清，用无血清培养基清洗3遍，加无血清培养基10 ml，同时加入bFGF，置5% CO2培养箱中培养2天后可供移植。

1.2.3神经干细胞移植和移植后行为学检测将标记有Hoechst33342的神经干细胞球收集后用胰酶消化和毛细吸管机械吹打制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数后分2管：1管加入纤维蛋白凝胶，另1管加无血清培养基，均调整细胞浓度至1105个/μl左右。将行为学检测成功的AD模型鼠麻醉后固定于立体定位仪上，切开皮肤，分离颅骨骨膜，钻孔。用微量进样器吸取神经干细胞悬液注射至两侧海马齿状回，每侧注射2.5 μl。支架组注入加纤维蛋白凝胶的神经干细胞悬液，单纯干细胞移植组注入不加纤维蛋白凝胶的神经干细胞悬液，假手术组注入生理盐水。移植完毕后用骨蜡封闭颅孔，缝合切口，肌注青霉素10万U。术后30天起进行避暗回避试验和跳台试验，测试仪器和方法同上。; t8 O3 O9 e9 C+ j) X3 Q

1.2.4动物灌注、冰冻切片各组动物行为学检测完毕后麻醉，开胸经心灌注生理盐水100 ml及含有4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS（pH7.2） 400 ml，取脑后固定6 h。再分别经20%、30%蔗糖平衡，行冠状位冰冻连续切片。挑取带有移植区（假手术组挑取针道处）的切片，贴于涂布多聚赖氨酸的载玻片上。

1.2.5Hoechst33342与MAP-2免疫荧光双标检测将上述挑取的带有移植区的一套切片置于0.01mol/L PBS缓冲液（pH7.2）中漂洗3遍后，置入含有10%山羊血清的封闭液中，2小时后加1∶200稀释的小鼠抗MAP-2单抗，放入4 ℃冰箱中过夜。次日晨吸去一抗，用PBS清洗3遍后，加入1∶100稀释的结合有FITC的山羊抗小鼠二抗，避光、室温下轻轻振摇2小时。用PBS清洗3遍后，甘油磷酸缓冲液封片。分别在激发光波长为346 nm、吸收光波长为460 nm和在激发光波长为495 nm、吸收光波长为520 nm的荧光显微镜下观察Hoechst33342和MAP-2阳性的免疫荧光细胞并摄片。0 h, w( K1 _/ \: o  X/ V' y( b! J
( d  B  q/ ~0 M; K" l" B
1.2.6统计学方法采用Stata7.0统计软件，对各组动物移植前后避暗回避试验和跳台试验结果进行t检验。

2结果

2.1行为学检测FG支架组、单纯干细胞移植组和假手术组移植前、后避暗回避试验及跳台试验检测数据及统计分析详见表1。FG支架组移植前、后的探索次数、滞留时间、主动回避和总回避阳性率相比P均

2.2神经干细胞移植后Hoechst33342与MAP-2免疫荧光双标检测结果FG支架组和单纯干细胞移植组均有少量Hoechst33342（蓝色）与MAP-2（绿色）免疫荧光双标阳性细胞，提示移植的神经干细胞有部分能够分化成神经元。平均每视野Hoechst33342与MAP-2免疫荧光双标阳性细胞数：单纯干细胞移植组为4.16±0.19个；FG支架组为9.39±0.44个。FG支架组的免疫荧光双标阳性细胞（图1）明显多于单纯干细胞移植组（图2）。假手术组无双标阳性细胞发现。0 X; i+ @8 \! N
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3讨论! D/ v" A6 Q6 A& [1 e) e2 @
3 P# Q7 [8 q* p/ @
纤维蛋白黏胶是一种天然的细胞外基质，生物相容性、可塑性、可降解性良好，无细胞毒性，制备方便，近来越来越受到人们的关注。FG是纤维蛋白单体，是在凝血酶、氯化钙作用下聚合成的可塑形的、可黏附的和可降解的一种低抗原性的生物大分子材料，早已在临床上广泛使用，如止血、吻合口瘘的防治、促进伤口愈合、封闭体内空腔和蛛网膜下腔等[6]。纤维蛋白能较好的介导细胞间信号传导及其相互作用。纤维蛋白单体聚合成凝胶时，通过释放血小板源性生长因子(PDGF)和β转化生长因子(TGF-β)，促进细胞的增殖、成熟和胞外基质的合成[7]。总之，通过外源性神经干细胞植入或内源性神经干细胞激活来弥补由于神经元受损而变性或死亡导致的神经功能的减退是目前神经疾病治疗的新途径。选择适当的体外扩增条件，可增加神经干细胞的来源，理想的细胞支架是移植研究的重点，决定着移植后细胞的生存率和生存状态。
9 W4 R8 _4 [5 d' W& i2 B& r
本实验用纤维蛋白凝胶为支架将神经干细胞移植入穹隆海马伞切断的AD模型鼠海马，行为学结果证实明显好于单纯干细胞移植AD动物，免疫组织化学的方法进一步证实通过FG支架移植的神经干细胞较单纯移植的神经干细胞较多地分化成了神经元。目前尚未见到类似的报道，上述研究结果为以后临床上应用神经干细胞移植治疗AD奠定基础。) \0 |% d  D: ~' J6 T+ i
      【参考文献】# E( ?8 i  r3 g. d1 @4 K& G3 d$ H/ q
[1] Sun ZH, Lai YL, Zeng WW, et al.  Neural stem/progenitor cells survive and differentiate better in PD rats than in normal  rats [J]. Acta Neurochir Suppl， 2003,87（2）: 169-174.

# H0 y6 i4 ]  Z$ M. F. e5 w3 {
[2] Yang M, Stull ND, Berk MA, et al. Neural stem cells spontaneously express dopaminergic traits after transplantation into the intact or 6-hydroxydopamine- lesioned rat [J].  Exp Neurol， 2002,177(1):50-60.9 I( V8 v2 z; _9 [) e4 M

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[3] 阴金波，周政，杨辉，等.  神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究[J]. 中国临床康复，2003,7(6): 926-928.
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[4] Sugaya K, Brannen CL.  Stem cell strategies for neuroreplacement therapy in Alzheimer's disease[J]. Med Hypoth-eses， 2001, 57(6):697-700.
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[5] 施碧涛，武义鸣，徐慧君，等.  大白鼠老年痴呆模型的研究[J]. 功能性和立体定向神经外科杂志, 1990, 3(3):36-40.
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6 ~2 W& N# M  F% b: f, e) F0 k
[6] 胡运生, 范清宇, 马保安,等.  磷酸钙/纤维蛋白胶复合支架材料的结构及力学性能分析[J]. 功能材料，2006, 4(37): 607-610.: M) e7 m6 h9 `7 [$ h; o
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[7] Laidmae I, Salum T, Uibo R. Biological effect of Salmon fibrin glue on rats[J]. European Journal of Pharnaceutical Sciences, 2007,32（1）:22-50.

作者: 昕昕 时间: 2015-5-22 15:34

(*^__^*) 嘻嘻……

作者: 张佳 时间: 2015-5-23 10:27

(*^__^*) 嘻嘻……

作者: 大小年 时间: 2015-6-10 19:09

帮你顶，人还是厚道点好

作者: marysyq 时间: 2015-6-22 12:13

回答了那么多，没有加分了，郁闷。。

作者: awen 时间: 2015-7-2 10:53

都是那么过来的

作者: laoli1999 时间: 2015-7-24 12:48

不错，看看。

作者: bluesuns 时间: 2015-7-25 06:10

自己知道了

作者: bluesuns 时间: 2015-7-28 09:18

干细胞之家是国内最好的干细胞网站了

作者: 123456zsz 时间: 2015-8-3 15:01

我的妈呀，爱死你了

作者: 榴榴莲 时间: 2015-8-19 11:35

楼上的话等于没说~~~

作者: 123456zsz 时间: 2015-9-21 18:52

不错，看看。

作者: 橙味绿茶 时间: 2015-10-2 11:43

病毒转染干细胞

作者: aakkaa 时间: 2015-10-3 20:34

初来乍到，请多多关照。。。嘿嘿，回个贴表明我来过。

作者: tempo 时间: 2015-10-16 11:01

呵呵大家好奇嘛来观看下~~~~

作者: aakkaa 时间: 2015-10-29 08:19

说的不错

作者: xuguofeng 时间: 2015-11-1 04:25

有才的不在少数啊

作者: 杏花 时间: 2015-11-9 19:35

干细胞存储

作者: laoli1999 时间: 2015-11-12 11:54

干细胞与基因技术

作者: yukun 时间: 2015-12-10 17:40

干细胞库

作者: 罗马星空 时间: 2015-12-21 19:32

哦...............

作者: 依旧随遇而安 时间: 2015-12-29 13:27

嘿嘿......哈哈......呵呵.....哟~呼

作者: renee 时间: 2016-2-26 13:28

谢谢干细胞之家提供资料

作者: htc728 时间: 2016-4-19 11:18

支持你一下下。。

作者: HongHong 时间: 2016-4-26 12:34

我又回复了

作者: 碧湖冷月 时间: 2016-6-11 16:12

厉害！强~~~~没的说了！

作者: xiaomage 时间: 2016-6-21 18:54

支持你就顶你

作者: dypnr 时间: 2016-6-22 18:25

干细胞库

作者: 20130827 时间: 2016-7-1 21:53

我仅代表干细胞之家论坛前来支持，感谢楼主！

作者: marysyq 时间: 2016-7-5 18:10

顶．支持，路过．．．．．

作者: 昕昕 时间: 2016-7-15 16:26

真是汗啊我的家财好少啊加油

作者: biodj 时间: 2016-8-3 06:37

加油站加油

作者: HongHong 时间: 2016-8-4 20:29

干细胞库

作者: kaikai 时间: 2016-9-17 20:53

昨晚多几分钟的准备，今天少几小时的麻烦。

作者: 橙味绿茶 时间: 2016-10-16 04:52

怎么就没人拜我为偶像那?? ~

作者: 若天涯 时间: 2016-11-18 09:42

进行溜达一下

作者: 与你同行 时间: 2016-11-26 16:13

又看了一次

作者: xuguofeng 时间: 2016-12-13 12:26

站个位在说

作者: 旅美学者 时间: 2017-1-8 12:54

哈哈我支持你

作者: haha3245 时间: 2017-1-17 16:10

角膜缘上皮干细胞

作者: 我心飞翔 时间: 2017-1-22 13:26

顶．支持，路过．．．．．

作者: 生科院 时间: 2017-2-11 05:27

呵呵,支持一下哈

作者: 陈晴 时间: 2017-2-25 23:43

自己知道了

作者: ringsing 时间: 2017-3-1 23:23

知道了不错~~~

作者: laoli1999 时间: 2017-3-17 19:49

HOHO~~~~~~

作者: 化药所 时间: 2017-3-28 08:01

好好帖很好帖确实好帖少见的好帖

作者: 桦子 时间: 2017-4-4 22:18

支持一下

作者: sshang 时间: 2017-4-6 06:01

不错的东西持续关注

作者: ladybird 时间: 2017-4-8 22:32

呵呵,明白了

作者: 修复者 时间: 2017-4-15 16:34

干细胞治疗

作者: 罗马星空 时间: 2017-4-18 08:00

顶你一下，好贴要顶！

作者: 8666sea 时间: 2017-5-26 02:22

(*^__^*) 嘻嘻……

作者: netlover 时间: 2017-5-28 22:12

楼主，支持！

作者: 安生 时间: 2017-6-1 02:44

文笔流畅，修辞得体，深得魏晋诸朝遗风，更将唐风宋骨发扬得入木三分，能在有生之年看见楼主的这个帖子。实在是我三生之幸啊。

作者: xiaomage 时间: 2017-6-18 16:47

初来乍到，请多多关照。。。

作者: pengzy 时间: 2017-6-22 07:48

真是有你的！

作者: whyboy 时间: 2017-6-27 23:10

小生对楼主之仰慕如滔滔江水连绵不绝,海枯石烂,天崩地裂,永不变心.

作者: vsill 时间: 2017-7-10 21:41

知道了不错~~~

作者: renee 时间: 2017-7-12 20:41

干细胞研究非常有前途

作者: highlight 时间: 2017-7-25 15:44

好啊，谢楼主

作者: 我学故我思 时间: 2017-7-26 15:26

小生对楼主之仰慕如滔滔江水连绵不绝,海枯石烂,天崩地裂,永不变心.

作者: Kuo 时间: 2017-7-30 09:43

一个子没看懂

作者: 橙味绿茶 时间: 2017-9-7 18:21

@,@..是什么意思呀？

作者: 某某人 时间: 2017-9-18 16:35

初来乍到，请多多关照。。。嘿嘿，回个贴表明我来过。

作者: 蚂蚁 时间: 2017-9-21 22:35

谁都不容易啊 ~~

作者: ikiss 时间: 2017-10-3 01:07

这贴子你会收藏吗

作者: nauticus 时间: 2017-10-17 11:18

干细胞治疗

作者: whyboy 时间: 2017-11-28 03:04

皮肤干细胞

作者: doors 时间: 2017-12-3 06:22

你还想说什么啊....

作者: 昕昕 时间: 2017-12-24 10:01

干细胞之家是不错的网站

作者: renee 时间: 2017-12-26 05:58

站个位在说

作者: 加菲猫 时间: 2018-1-7 23:01

今天无聊来逛逛

作者: cjms 时间: 2018-1-8 04:50

帮你项项吧

作者: marysyq 时间: 2018-1-16 04:25

应该加分

作者: 心仪 时间: 2018-1-28 13:26

你加油吧

作者: ines 时间: 2018-2-4 09:26

好好帖很好帖确实好帖少见的好帖

作者: beautylive 时间: 2018-2-21 06:22

严重支持！

作者: xm19 时间: 2018-3-27 12:34

支持~~顶顶~~~

作者: 命运的宠儿 时间: 2018-4-8 18:29

不错啊! 一个字牛啊!

作者: www1202000 时间: 2018-4-11 19:33

支持一下吧

作者: dogcat 时间: 2018-4-16 18:13

嘿嘿

作者: 坛中酒 时间: 2018-5-10 09:35

你还想说什么啊....

作者: DAIMAND 时间: 2018-5-28 07:29

支持你就顶你

作者: 小倔驴 时间: 2018-6-23 10:43

今天无聊来逛逛

作者: ikiss 时间: 2018-7-8 21:51

不错，支持下

作者: 温暖暖 时间: 2018-7-11 14:27

这个贴不错！！！！！看了之后就要回复贴子，呵呵

作者: pspvp 时间: 2018-7-31 16:34

胚胎干细胞

作者: whyboy 时间: 2018-7-31 21:06

看完了这么强的文章，我想说点什么，但是又不知道说什么好，想来想去只想

作者: awen 时间: 2018-8-4 10:54

干细胞研究非常有前途

作者: ladybird 时间: 2018-8-28 22:35

顶你一下，好贴要顶！

作者: dreamenjoyer 时间: 2018-9-16 09:00

其实回帖算是一种没德德，所以我快成圣人了

作者: 修复者 时间: 2018-9-25 01:32

干细胞从业人员

作者: kaikai 时间: 2018-10-28 14:34

每天早上起床都要看一遍“福布斯”富翁排行榜，如果上面没有我的名字，我就去上班……

作者: tuting 时间: 2018-10-30 08:11

好贴坏贴，一眼就看出去

作者: xuguofeng 时间: 2018-11-8 21:43

非常感谢楼主，楼主万岁万岁万万岁！

作者: 陈晴 时间: 2018-11-10 00:06

顶顶更健康，越顶吃的越香。

作者: laoli1999 时间: 2019-1-4 09:27

不错不错.,..我喜欢

作者: 考拉 时间: 2019-1-23 15:10

先顶后看

作者: 苹果天堂 时间: 2019-1-24 10:54

初来乍到，请多多关照。。。

作者: s06806 时间: 2019-2-1 13:16

做一个,做好了,请看

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