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【摘要】 目的： 探讨体外分化的小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织单个心肌细胞获取方法. 方法： 用胰酶、胶原酶溶液消化乳大鼠心室肌组织及小鼠胚胎干细胞源心肌细胞，获得细胞悬液经Percoll分离纯化后，再低密度接种富集的心肌细胞，通过光镜观察获得的单个跳动的心肌细胞，采用免疫组织化学和激光共聚焦方法鉴定心肌细胞. 结果： 乳大鼠心室肌组织及小鼠胚胎干细胞源心肌细胞用胰酶、Dispase酶消化，经Percoll分离纯化后，能获得纯的单个心肌细胞，光镜下单个心肌细胞收缩明显而有力.免疫组织化学和激光共聚焦观察发现单个心肌细胞中有肌原纤维束. 结论： 使用胰酶、Dispase酶消化后，经Percoll分离纯化可从体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织获得活性良好的单个心肌细胞. % b6 G. L* {, { 【关键词】小鼠; 胚胎; 干细胞；心肌/细胞学；细胞培养技术 " b! c# P4 s, b# ?9 C Method to get single cardiomyocyte from embryonic stem cells differentiated in vitro and neonatal rat ventricular tissues$ m5 O% I; c% Y, Q6 u5 }
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YU ChangHai, LIU Ying, LI Jie，ZHANG YiMing, YU JianQi ) y& |' {. m4 Y5 Z7 X2 i7 O9 F- [; z4 M- \: b0 n- u4 ], q) h
Department of Cardiothoracic Surgery, First Affiliated Hospital, PLA General Hospital, Beijing100037, China 0 a( u" m- A& \2 k4 e7 M- S g" [5 z0 A8 E, h7 M6 q
【Abstract】 AIM：To find a method to get single cardiomyocyte from mouse embryonic stem cells(mES cells) differentiated in vitro and neonatal rat ventricular tissues. METHODS: Neonatal rat ventricular tissues anddifferentiated mouse embryonic stem cells were digested by trypsin and dispase. After discontinuous Percoll gradient centrifugation, the enriched cardiomyocytes were planted at a low concentration. Cardiomyocytes were observed and identified by light microscope and immunohistochemistry and confocal laser scanning microscopy(CLSM). RESULTS: After discontinuous Percoll gradient centrifugation, the enriched cardiomyocytes were arranged in loose and interlacing networks of single cells. The single cardiomyocyte beat spontaneously under light microscope. and exhibited strands of elongated and well developed myofibrils. CONCLUSION: This method could get single cardiomyocyte with good morphology and vitality from defferentaited mES cells and neonatal rat ventricular tissues.* a4 r7 U3 H' M/ d
5 v2 @! _3 O# K7 ]0 H% G 【Keywords】mic embryo; stem cells; myocardrum/cytology; cell culture techniques" S/ {- V! b" w2 s0 G g5 ~" e8 d
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0引言 % ?* O, {7 m1 a) n6 c. R& n- R, V3 y' \5 S& E A
目前，由于缺少能模拟心肌细胞发育的心肌细胞系, 并且早期胚胎心脏太小, 心肌细胞是怎样由它的前身细胞分化而来，心肌基因表达及不同离子通道的功能表达之间的关系以及形态和离子通道调控变化的关系等研究受到阻碍.随着胚胎干细胞的研究及技术发展, 以上各项研究都可利用从多能小鼠胚胎干细胞在体外分化成心肌细胞的模型加以研究.我们将介绍体外分化小鼠胚胎干细胞及乳大鼠心室肌组织单个心肌细胞的获取方法. . ]6 K9 ], ~' `. K o$ l! W% Q# l3 s3 q+ a0 [/ R
1材料和方法5 G e! c, |% k( o
( E9 g* [+ K, \ @) p 1.2.5.1免疫组织化学染色Percoll分离后培养3 d的细胞，经PBS清洗2次，丙酮固定后用抗肌钙蛋白T抗体作免疫组化鉴定.细胞经PBS漂洗35 min，100 mL/L封闭血清作用20 min，弃血清，加抗心肌肌钙蛋白T抗体（1∶100），4℃过夜. PBS漂洗35 min，加入二抗（生物素标记的羊抗小鼠试剂盒），37℃孵育45 min；PBS漂洗35 min，辣根标记的链霉卵白素37℃作用45 min. PBS漂洗35 min，DAB显色，自来水洗，细胞核苏木素衬染，二甲苯透明，封片. 用PBS代替一抗作为阴性对照. ) D7 q2 x5 W" b' Z; C( |' o) T1 s+ G
1.2.5.2 激光共聚焦观察Percoll分离后培养4 d的细胞经PBS漂洗2次，丙酮固定10 min，PBS漂洗35 min. 室温下用5 g/L TritonX100作用10 min，封闭血清处理20 min. 4℃条件下同一抗（抗a辅肌动蛋白，1∶800，Sigma）作用过夜，PBS漂洗35 min，与FITC标记的二抗（抗大鼠IgG, 1∶50，）室温下作用45 min，PBS漂洗35 min，然后用TRITC标记的phalloidin(50 mg/L，Sigma)在室温下与样本作用40 min，以显示肌动蛋白.PBS漂洗35 min，Hoechst33258染核15 min，PBS漂洗35 min.用900 g/L的甘油PBS溶液支撑盖玻片，激光共聚焦显微镜观察.( R& i- M N4 P4 Y, l
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2结果0 k* j6 O9 q& j8 y
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2.1单个心肌细胞的培养和形态学观察未贴壁的细胞呈球形或椭圆形，培养2～3 h后细胞开始贴壁生长，24 h后细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，搏动的频率、节律不同，呈圆形，梭形，三角形、多边形等形态；第3日时贴壁的心肌细胞逐渐形成细胞簇或细胞单层，跳动的细胞明显增多，跳动节律不同；第7日时细胞伸出的伪足已相互接触，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，收缩明显而有力，形成功能性合胞体细胞（图1）. & y+ ?* O2 B ^4 F( Y4 k5 L7 U2 t: p3 M# h% r+ i
2.2单个心肌细胞的鉴定9 W0 j( C+ P6 @3 r9 X$ w
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细胞贴壁培养3 d后行肌钙蛋白T免疫组织化学染色发现，细胞呈阳性（图2）. 在激光共聚焦显微镜下观察，αsarcomeric actin显示红色，αactinin 显示绿色，核为蓝色. 叠加后，可显示心肌细胞中形成红绿相间的肌原纤维（图3）. ( V3 K. z d' b# H, @0 p! [) y3 C3 X, |' S. u' m$ S3 N
3讨论 ) F) z( ~5 H) y3 | " z8 e4 ]# S' e2 G/ x' a 1981年，小鼠ESC的成功分离、建系揭开了干细胞研究的序幕［5］. 继之，ESC定向诱导分化研究成为国内外研究人员共同关注的热点之一. Percoll是一种表面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅胶颗粒.该密度梯度分离剂无毒、无刺激性，对细胞无吸附作用，产生的渗透压很小，因此在全部密度范围保持等张［6］.国内外研究人员应用Percoll成功地对多种细胞进行了分离，均取得良好分离效果［7-9］.我们采用胰酶、Dispase酶消化乳大鼠心室肌组织及分化的小鼠胚胎干细胞，经Percoll分离纯化后能获得单个心肌细胞.光镜下单个心肌细胞自发地有节律性地收缩，免疫组织化学染色和免疫荧光染色证实为心肌细胞. + a& j9 M' U8 z6 O s * E3 r- k0 |+ `$ P5 ~5 V 本实验结果表明，采用胰酶、Dispase酶消化乳大鼠心室肌组织及分化的小鼠胚胎干细胞，经Percoll分离纯化可获得形态、活力良好的单个心肌细胞.这些心肌细胞可以用于心肌细胞的发育、生理、病理、药理、毒理、能量代谢等研究，还可以作为心肌组织工程的种子细胞. & B! p- K: H9 c, Y' k& c: Q 【参考文献】 " X$ W7 W4 W: T ［1］Martin GR. Isolation of a pluripotent line from early mouse embryos cultured in Medium conditional by teratocarcinoma stem cell［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1981, 78(12) :7634-7638. & i" |6 h+ L, i4 M& e/ }% P1 x H* h$ \! B
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