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标题: 神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究 [打印本页]

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作者: 文献管理员    时间: 2009-3-3 12:34     标题: 神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验研究

作者：许祖远，方煌*，罗永湘作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉  430030   n* ^7 k# E3 @1 B
                  
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          【摘要】  目的］观察神经干细胞静脉移植对损伤大鼠脊髓功能的治疗作用。［方法］取孕14～16 d SD胎鼠的脑室下区组织，体外培养后鉴定细胞。制作脊髓全切模型，伤后1周将Brdu标记好的神经干细胞通过尾静脉注射移植到大鼠体内，移植后及8周行皮层体感诱发电位（CSEP）检测和BBB功能评分，并留损伤脊髓处作病理切片及免疫组化染色。［结果］（1）移植后8周BBB评分损伤组、移植组都有所恢复，但都未达到正常水平，移植组恢复较好；（2）模型制作后，CSEP波均消失，细胞移植后8周移植组的波形有不同程度的恢复，但潜伏期延长；（3）移植组大鼠脊髓损伤处存在大量Brdu染色阳性细胞，表明移植的细胞在体内可到达损伤脊髓处并能存活；脊髓损伤部位NF-200及GFAP染色阳性的细胞表明移植的细胞可以分化为具有神经元和胶质细胞特性的细胞。［结论］静脉移植的神经干细胞能到达损伤区代替受损的神经元及神经胶质细胞，使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。
0 E$ X3 m+ L# i' ]5 V          【关键词】脊髓损伤；  神经干细胞；  静脉移植；  功能恢复2 \7 v: c. j; y! ~" I! _
                  
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　　脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后自身的修复能力非常有限，死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的研究改变了这一观点。神经干细胞［1,2］是一类存在于中枢神经系统内具有多向分化能力的细胞，能分化成少突胶质细胞、神经元、星形胶质细胞。人们已经把神经干细胞视为治疗脊髓损伤的理想移植细胞。神经干细胞移植治疗脊髓损伤的途径可分为2种：(1)移植物直接植入脊髓损伤部位，此法可导致局部移植物的高密度存在，有利于局部神经纤维的再生;(2)移植物通过血液循环系统到达损伤部位。有关报道表明神经干细胞可以通过损伤部位的血脑—血脊髓屏障到达损伤部位从而修复损伤［3］。本实验旨在研究神经干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的疗效，为临床进一步治疗脊髓损伤提供科学依据奠定基础。
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　　1材料与方法1 |. Q8 j& Y* Z* U  Z

; T, B# ?- y( C/ r5 O! |& F2 I　　1.1免疫组化试剂
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) M3 Q4 }2 M1 Q　　化学试剂5-溴脱氧尿核苷(Brdu)、小鼠抗Brdu单克隆抗体购于Sigma公司；小鼠抗巢蛋白(nestin)多克隆抗体购于Chemicon公司；小鼠抗胶质细胞酸性蛋白(GFAP)IgG1、小鼠抗神经元丝蛋白(NF-200)IgG1及FITC标记的羊抗IgG1购于武汉博士德公司；亲和素标记的Cy3购于KPL公司；细胞因子EGF、bFGF均购于Pepro Tech EC公司。& E& |  W/ n/ `6 m
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　　1.2胎鼠来源的NSCs的制备、培养、分化与鉴定［4］; }6 h) V. n( b) N4 K, w6 P! m

3 O6 @. D1 P* u$ G; J2 @　　1.2.1取胚龄14～16 d［2，5］SD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞，以1.5105个细胞／ml种瓶，用DMEM／F12(1：1)(Sigma)无血清培养基培养［内含bFGF20 ng／ml、EGF20 ng／ml、B2720 nl／ml(GibCOBRL)］。每3～4 d换液1次。
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　　1.2.2对第2代细胞作免疫组化鉴定取无血清培养基贴壁分化培养24 h的盖玻片1张，4％多聚甲醛固定30 min。0.25％Triton-100破膜12 min，然后用5％脱脂奶粉封闭特异性抗原，室温孵育30 min，吸干残液滴加1：500小鼠抗大鼠nestin IgG1(I抗)，4℃孵育过夜。第2 d滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1 Ⅱ抗，室温孵育1 h，然后50％缓冲甘油封气，荧光显微镜下观察并摄像。
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　　1.2.3神经干细胞分化鉴定［6］神经球经机械吹打后接种到多聚赖氨酸包被的玻片上，培养基换为含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基。分化7 d后，行神经元丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组化实验。荧光显微镜下观察并摄像。' v! [, F/ \1 Z2 d

2 M  k5 A/ w( Z0 a8 |5 P, {" _, G. H　　1.3脊髓损伤模型的制备
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' q5 X, u1 |9 b9 G! m. f# R3 j　　1.3.148只成年Wistar大鼠，体重(250±50)g，雌雄不拘，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。动物腹腔麻醉后，背部剪毛，常规碘酒酒精消毒。沿脊柱正中切开皮肤，分离肌肉，暴露椎骨，用咬骨钳仔细咬去椎板，在T9与T11椎骨平面打开椎管，充分暴露T10节段脊髓背面及两侧，用弯头眼科镊将脊髓轻轻挑起，用眼科剪将脊髓完全剪断，将分离的肌肉缝合封闭椎管缺损，缝合皮肤，制成脊髓损伤模型。
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　　1.3.21周后有45只存活，将模型动物随机分为3组，每组15只：（1）正常组(A组)：仅行切皮、打开椎管，不施行SCI；（2）损伤组(B组)：脊髓全横断损伤；（3）移植组(C组)：在脊髓完全横断后1周移植大鼠NSCs悬液。术后14 d内每天腹腔注射青霉素(1104 u／100 g)。每天将动物的膀胱人工排空2次，直到动物自身排尿反射恢复。0 X) e4 B" a. S9 {, w/ I
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　　1.4NSCs的静脉移植
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　　1.4.1移植前的细胞准备移植前12 h，在鉴定的第2代前体细胞中加入Brdu溶液(5 μmol／l)标记，37℃、5％CO2孵育。移植前调整细胞浓度为5104／μl，放入冰中待移植。- X- u# E+ L- ]4 f3 k

( u1 B6 h1 l9 q  L2 a　　1.4.2C组伤后1周尾静脉注射移植NSCs悬液，量为100 μl［7］。B组注射等量的生理盐水。
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　　1.5BBB功能评分［8］评价大鼠下肢功能
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6 z% {4 C& f) B　　行为学检测参照Basso等提出的大鼠SCI后功能评判标准(简称BBB评分法)对各实验动物后肢的运动功能进行评分。所有观察都在上午进行，评分前应将所有动物的膀胱排空，时间为4 min，评分时采用双盲法。. O! e: d& G7 H* c
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　　1.6动物皮层体感诱发电位(CSEP)的测定［9］- j8 v7 l% L$ L& M% \# D7 @
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- A& Z$ l. R& g　　模型动物在术后1 d及9周行CSEP检查。每只动物均测双下肢。8 s# g, ]' c" @4 \9 u7 T
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　　1.7组织免疫组化检测
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9 N+ S8 F+ E9 X0 Z9 L  o5 r. b　　试验大鼠在移植8周后过度麻醉并作4％多聚甲醛灌注。取出脊髓，4％PFA固定后作石腊切片。
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$ B" G  _, b' s9 I0 q7 l  l4 X　　1.7.1Brdu和nestin 双标免疫组化染色* V! n; h$ ~  h# U/ |
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　　1.7.2Brdu和GFAP双标免疫荧光染色检测+ k" U8 e. Z; ~( s* D( {. [3 g
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　　1.7.3组织行Brdu和NP双标免疫荧光染色检测
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　　1.8统计学处理! C3 N) I; G: T  Z. A% C, o6 X

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　　所有数据采用SPSS 12.0程序分析，P
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　　2结果+ g: I) K2 F0 W  c7 e# G9 [

1 F7 U3 A- _0 R9 E) J8 y　　2.1神经干细胞的培养、分化和鉴定情况
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　　2.1.1细胞培养神经干细胞在含有丝裂原的无血清培养基中进行体外培养，能保持其未分化的多潜能状态，并可进行大量增殖，换液后细胞生长迅速，分裂加快。在合适条件下体外培养1周左右，随着神经干细胞的不断扩增，形成悬浮生长的神经球(neurosphere)(图1)。神经球周边可长出绳索状纤维结构，相邻神经球之间可见有纤维联结(图2)。
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& _! d3 p7 ?9 f) V* A6 ~　　2.2.2神经干细胞的鉴定神经干细胞是一类未成熟细胞，选择性地表达某些抗原标志，如巢蛋白(nestin)，属中间丝蛋白。本实验nestin免疫荧光结果发现单个神经干细胞的胞浆有明显的荧光着色(图3)。神经干细胞增殖形成的神经球也有明显的荧光(图4)。0 S9 z) D6 H+ T0 k
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　　2.3神经干细胞的分化能力鉴定2 F% l' E5 G: n$ ?7 n2 F2 B

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　　神经干细胞具有多分化潜能，能够分化出神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。神经元丝蛋白(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)分别是神经元和星形胶质细胞特异性抗原标志。为了证实神经干细胞的多分化潜能，神经干细胞在撤掉丝裂原并加入血清分化1周，对分化细胞进行免疫组织化学鉴定。实验发现，分化的细胞中有NF和GFAP阳性的细胞(图5、6)。$ }7 G4 G) d1 S& c( B

$ Q8 e" P1 ^0 T/ l" Y, H; D& x　　2.4CSEP测定［9］
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　　所有实验动物在术前、术后1周及术后9周作CSEP测定。大鼠CSEP的波形为“W”形，所有大鼠在术前和A组术后的潜伏期正常；术后1周，B组和C组的CSEP消失，移植后8周B组的波形仍无，C组的波形恢复，但潜伏期延长(P) g" A! ^  F9 C" \/ G# w, Z
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　　表1各组动物的皮层体感诱发电位潜伏期（略）: {- V+ \" Q0 l- h) F: j6 `
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　　2.4功能评价- h# `7 x* }' D4 i/ ]: ?, f$ A

2 Y: J% f0 e4 z) i& x/ _1 a　　2.4.1大鼠经脊髓全横断手术后，双后肢完全瘫痪，BBB评分均为0分。脊髓损伤组在存活期内双后肢运动功能无明显变化，仅个别动物可出现1个或2个关节的轻微运动。BBB评分法是将大鼠后肢运动分为22个等级。后肢全瘫为0分，完全正常为21分，而2种状态之间根据功能分别定为1～20分［8］。本研究显示B组脊髓全横断9周后大鼠BBB评分为0.70±0.37,静脉移植组NSCs后为3.50±1.08，说明移植NSCs对大鼠后肢运动功能有一定的促进作用，这可能与运动神经通路的重建有关(表2)。% U! K: N. q1 V2 d' M
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　　表2各组动物的BBB评分结果（略）
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+ P6 U* K+ l: y, `2 o　　2.5组织免疫组化结果. W% Q6 Q* g$ m- X% S; ]

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/ {: j  r7 }3 K' `　　神经干细胞在损伤脊髓内的存活、迁移及分化在荧光显微镜下观察，可见神经干细胞移植组的脊髓损伤附近有大量被Brdu标记的移植细胞。损伤组中未见Brdu阳性的神经干细胞，nestin阳性的细胞较少的散在于病灶之中(图7)，NF-200阳性的神经纤维较少，GFAP阳性的再生神经纤维数量亦较少。移植组中可见Brdu阳性的神经干细胞分布于损伤区并向两侧延伸，在脊髓横断邻近的约1个节段移植细胞呈散在分布。在远离横断处的脊髓内移植细胞主要分布于白质中，排列较整齐，与脊髓纵轴平行，大量NF阳性的神经纤维及GFAP阳性的再生神经纤维分布其中。移植组大鼠脊髓损伤处存在大量Brdu和nestin双标染色阳性细胞(图8)，表明移植的细胞在体内可以到达损伤脊髓处并能存活；脊髓损伤部位Brdu和NF-200(图9)及Brdu和GFAP(图10)双标染色阳性的细胞表明移植的细胞可以分化为具有神经元和胶质细胞特性的细胞，其中GFAP阳性细胞多于NF-200阳性细胞。; G) a$ M# Q8 j

, v2 j$ q. `: b+ j% j! P　　3讨论& V, a4 @2 a! ^( A  n& h

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% f1 \$ O. ^; m* y' b0 ^　　NSCs的移植被认为是修复SCI最有希望的治疗方案。McDonald等［10］实验证明，小鼠胚胎NSCs植入损伤的大鼠脊髓后，植入细胞存活，并分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元,且能从损伤处向周围迁移，使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。表明移植的NSCs能够替代损伤、死亡的神经元，重建神经元回路，并在脊髓损伤部位起连接中断的作用。NSCs移植到脊髓受损部位后，能够分泌大量的治疗性因子，以防止神经元死亡并促进神经再生。因此，不管何种途径被移植到损伤大鼠体内的干细胞要求能够到达损伤部位并能存活相当长的时期，与宿主脊髓组织整合。! D0 @8 ^+ e, R! K
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4 R; N# b& X4 p1 C$ x4 V4 ~( m　　被横断的脊髓在损伤后将出现急性炎症反应［11］，有神经毒性的炎症因子含量急剧升高，如IL-6、IL-1、TNF-α等，可引起脊髓残端变性、坏死和空洞形成而产生脊髓损伤后自切现象，这一过程需要1周左右。在损伤后1周内进行移植会出现移植细胞的坏死现象；如在损伤后较长时间移植，神经纤维再生很难通过胶质瘢痕；一般认为在损伤后1周左右移植可以阻碍胶质组织瘢痕生成，利于移植物的生长。为此本实验以伤后1周作为细胞移植时间。
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6 v. x, R$ A& }* M( @1 y2 |　　Sufan等［12］把从大鼠胚胎(E16)海马中分离出含有NSCs的神经球注入第四脑室中，通过脑脊液转运，在损伤脊髓处的软脊膜形成细胞群，并扩散至脊髓、神经根。植入的NSCs良好地整合到宿主脊髓中，在脊髓中它们像星形胶质细胞伸出突起包被神经纤维，在神经根处则像雪旺细胞一样包被有髓纤维或整合到无髓神经束中。Kon Chu［7］等把体外培养的人神经干细胞通过尾静脉移植到大鼠脑缺血模型，发现移植细胞能够通过血液循环和血脑屏障到达损伤病灶处存活、分化，使动物缺血的症状得到一定的改善。并在动物的肾脏、肺、脾脏内发现移植的细胞，通过常规组织学检查并未发现组织破坏现象和新生物形成。由此可见神经干细胞具有极低的免疫原性，几乎不引起宿主的排斥反应。; N% r& ]. C5 V% G# E

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　　本实验采用神经干细胞悬浮球培养方法和Nestin抗体鉴定相结合，成功建立神经干细胞体外培养体系。将培养的神经干细胞通过静脉移植入损伤大鼠体内，结果发现接受神经干细胞移植的大鼠脊髓功能恢复明显优于损伤组，至移植后第8周评分发现，静脉移植组平均得分高于损伤组2.80分，经统计学检验差异有显著性意义，说明神经干细胞移植治疗可以显著促进损伤脊髓的功能恢复。细胞移植后及移植后8周的双下肢CSEP的测定也同样证明了这一点。同时，免疫组织化学检测证实移植的细胞能够通过血管系统和血脑屏障到达损伤脊髓部位存活并在损伤部位可以分化为神经丝蛋白抗体(NF-200)及胶质原纤维酸性蛋白抗体(glial fibrillary acidic protein，GFAP)染色阳性的细胞，也证实了移植的细胞可以分化为具有神经元或胶质细胞特性的细胞。这都说明移植的神经干细胞促进了损伤的脊髓组织修复，与脊髓功能的恢复相对应。神经干细胞移植促进损伤脊髓功能恢复的机制还不十分清楚，可能有以下三点：（1）神经于细胞分化后产生的神经元和胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达，使损伤轴突开始再生。它们同时产生多种细胞外基质，填充脊髓损伤后遗留的空腔，为再生的轴突提供支持物；（2）补充外伤后缺失的神经元和胶质细胞；（3）使残存脱髓鞘的神经纤维和新生的神经纤维形成新的髓鞘，保持神经纤维功能的完整性。. U0 d% Q6 A, z# T! V% a  ?6 r
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" W3 Y) J4 R, M/ a3 W+ y% c　　未来的研究方向有：植入的神经干细胞在损伤的脊髓中最终分化的命运和从血液到达脊髓损伤局部的机制；损伤的脊髓局部环境影响神经干细胞命运的分子机制和静脉移植与局部移植相比较的疗效差异等。本实验所取得的结果有了一个好的开始，相信不久的将来，神经干细胞移植最终能够成为治疗临床脊髓损伤患者的有效方法。
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　　(本文附图见加页2)（略）
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作者: beautylive    时间: 2015-5-25 16:01

顶的就是你  

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作者: 命运的宠儿    时间: 2015-6-18 08:54

我在顶贴~！~  

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作者: 兔兔    时间: 2015-6-30 15:01

貌似我真的很笨????哎  

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作者: immail    时间: 2015-7-6 15:15

爷爷都是从孙子走过来的。  

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作者: 命运的宠儿    时间: 2015-7-31 18:35

初来乍到，请多多关照。。。嘿嘿，回个贴表明我来过。  

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作者: nauticus    时间: 2015-9-1 22:47

我来了~~~~~~~~~ 闪人~~~~~~~~~~~~~~~~  

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作者: s06806    时间: 2015-9-19 20:27

我来看看！谢谢  

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作者: laoli1999    时间: 2015-10-5 14:27

终于看完了~~~  

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作者: 科研人    时间: 2015-10-28 07:12

不对，就是碗是铁的，里边没饭你吃啥去？  

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作者: foxok    时间: 2015-11-29 14:41

好人一个  

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作者: txxxtyq    时间: 2015-12-14 23:01

干细胞之家是国内最好的干细胞网站了

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作者: yukun    时间: 2015-12-16 10:01

偶啥时才能熬出头啊.  

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作者: immail    时间: 2015-12-23 16:41

不早了 各位晚安~~~~  

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作者: 123456zsz    时间: 2016-2-14 15:25

我想要`~  

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作者: 陈晴    时间: 2016-2-15 16:43

楼上的话等于没说~~~  

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作者: aliyun    时间: 2016-2-18 22:27

说的不错  

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作者: 碧湖冷月    时间: 2016-3-12 10:43

不错，看看。  

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作者: marysyq    时间: 2016-3-23 19:53

问渠哪得清如许，为有源头活水来。  

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作者: 苹果天堂    时间: 2016-4-3 13:43

支持你一下下。。  

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作者: s06806    时间: 2016-4-27 13:43

非常感谢楼主，楼主万岁万岁万万岁！  

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作者: mk990    时间: 2016-5-18 20:01

感谢党和人民的关爱~~~  

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作者: doors    时间: 2016-5-25 18:16

设置阅读啊  

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作者: immail    时间: 2016-6-4 20:24

其实回帖算是一种没德德，所以我快成圣人了  

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作者: yukun    时间: 2016-6-22 16:33

你还想说什么啊....  

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作者: ringsing    时间: 2016-6-23 17:27

顶你一下，好贴要顶！  

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作者: beautylive    时间: 2016-7-28 22:27

不是吧  

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作者: feixue66    时间: 2016-7-30 14:42

琴棋书画不会，洗衣做饭嫌累。  

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作者: dd赤焰    时间: 2016-8-10 16:18

干细胞之家是国内最好的干细胞网站了

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作者: xuguofeng    时间: 2016-8-30 16:32

呵呵，等着就等着....  

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作者: highlight    时间: 2016-9-5 21:52

知道了 不错~~~  

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作者: 杏花    时间: 2016-9-30 10:54

帮你项项吧  

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作者: IPS干细胞    时间: 2016-10-9 20:54

帮你项项吧  

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作者: lab2010    时间: 2016-12-1 00:16

顶也～  

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作者: dd赤焰    时间: 2016-12-4 13:42

你还想说什么啊....  

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作者: 再来一天    时间: 2017-1-6 14:10

朕要休息了..............  

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作者: dataeook    时间: 2017-2-18 17:48

帮你项项吧  

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作者: feixue66    时间: 2017-3-23 22:16

很好！很强大！  

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作者: 墨玉    时间: 2017-4-16 14:10

我是来收集资料滴...  

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作者: lab2010    时间: 2017-5-4 14:36

写得好啊  

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作者: 红旗    时间: 2017-5-20 09:01

(*^__^*) 嘻嘻……   

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作者: lalala    时间: 2017-5-26 08:43

我的啦嘿嘿  

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作者: 泡泡鱼    时间: 2017-5-30 23:19

肿瘤干细胞

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作者: 陈晴    时间: 2017-6-11 14:42

佩服佩服啊.  

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作者: youngcell    时间: 2017-7-18 20:23

干细胞库  

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作者: 三星    时间: 2017-7-25 05:00

这年头，分不好赚啊  

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作者: biopxl    时间: 2017-7-27 08:35

羊水干细胞

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作者: 蚂蚁    时间: 2017-7-27 22:09

只有一条路不能选择——那就是放弃的路；只有一条路不能拒绝——那就是成长的路。  

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作者: apple0    时间: 2017-8-5 17:06

这个贴不错！！！！！  

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作者: 快乐小郎    时间: 2017-8-7 08:35

你加油吧  

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作者: htc728    时间: 2017-8-20 08:43

我起来了 哈哈 刚才迷了会  

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作者: www1202000    时间: 2017-10-3 04:43

不错 不错  比我强多了  

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作者: 我学故我思    时间: 2017-10-3 05:17

神经干细胞

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作者: HongHong    时间: 2017-10-4 09:27

我回不回呢 考虑再三 还是不回了吧 ^_^  

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作者: heart10    时间: 2017-10-20 12:54

好贴子好多啊  

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作者: tian2006    时间: 2017-11-3 05:22

世界上那些最容易的事情中，拖延时间最不费力。  

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作者: 榴榴莲    时间: 2017-11-12 11:34

感谢党和人民的关爱~~~  

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作者: 老农爱科学    时间: 2017-11-18 21:54

先顶后看  

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作者: 若天涯    时间: 2017-11-25 03:16

我喜欢这个贴子  

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作者: 我学故我思    时间: 2017-12-2 18:16

楼主也是博士后吗  

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作者: doors    时间: 2017-12-13 19:12

声明一下：本人看贴和回贴的规则，好贴必看，精华贴必回。  

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作者: na602    时间: 2017-12-17 03:53

说的不错  

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作者: 海小鱼    时间: 2017-12-20 22:53

看完了这么强的文章，我想说点什么，但是又不知道说什么好，想来想去只想  

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作者: 小倔驴    时间: 2018-1-9 13:42

想都不想，就支持一下  

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作者: 生物小菜鸟    时间: 2018-1-21 01:06

我该不会是最后一个顶的吧  

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作者: hmhy    时间: 2018-2-17 01:34

真是汗啊  我的家财好少啊  加油  

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作者: biodj    时间: 2018-2-20 09:54

我好想升级  

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作者: doors    时间: 2018-3-12 11:10

挤在北京，给首都添麻烦了……  

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作者: 安安    时间: 2018-3-14 13:00

真是天底下好事多多  

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作者: 舒思    时间: 2018-3-19 09:27

不看白不看，看也不白看  

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作者: leeking    时间: 2018-4-7 02:08

好啊，谢楼主

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作者: bioprotein    时间: 2018-5-3 08:18

今天的干细胞研究资料更新很多呀

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作者: 黄山    时间: 2018-5-6 01:39

我来了~~~~~~~~~ 闪人~~~~~~~~~~~~~~~~  

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作者: 小倔驴    时间: 2018-5-7 04:52

文笔流畅，修辞得体，深得魏晋诸朝遗风，更将唐风宋骨发扬得入木三分，能在有生之年看见楼主的这个帖子。实在是我三生之幸啊。  

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作者: 罗马星空    时间: 2018-5-16 04:06

帮你项项吧  

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作者: doc2005    时间: 2018-5-26 10:27

嘿...反了反了,,,,  

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作者: 再来一天    时间: 2018-5-31 17:09

站个位在说  

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作者: leeking    时间: 2018-6-29 00:40

做一个,做好了,请看  

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作者: foxok    时间: 2018-7-2 12:10

楼上的话等于没说~~~  

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作者: DAIMAND    时间: 2018-7-2 21:31

一个人最大的破产是绝望，最大的资产是希望。  

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作者: 若天涯    时间: 2018-7-3 00:31

一个子 没看懂  

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作者: 昕昕    时间: 2018-7-9 11:27

一定要回贴，因为我是文明人哦  

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作者: yukun    时间: 2018-7-23 18:43

鉴定完毕.!  

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作者: www1202000    时间: 2018-7-24 01:35

角膜缘上皮干细胞

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作者: 123456zsz    时间: 2018-8-10 20:30

既然来了，就留个脚印  

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作者: DAIMAND    时间: 2018-8-18 10:43

加油啊！！！！顶哦!!!!!  

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作者: 三星    时间: 2018-8-19 18:35

支持你一下下。。  

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作者: 水木清华    时间: 2018-8-24 17:30

支持你加分  

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作者: doc2005    时间: 2018-9-26 16:07

好帖子，要顶！

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作者: 生物小菜鸟    时间: 2018-10-7 03:14

小心大家盯上你哦  

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作者: 糊涂小蜗牛    时间: 2018-10-17 13:01

帮你顶，人还是厚道点好  

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作者: 桦子    时间: 2018-10-24 04:10

不管你信不信，反正我信  

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作者: 桦子    时间: 2018-10-24 19:41

神经干细胞

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作者: frogsays    时间: 2018-11-5 01:35

其实回帖算是一种没德德，所以我快成圣人了  

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作者: 修复者    时间: 2018-11-6 09:27

老大,我好崇拜你哟  

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作者: dmof    时间: 2018-11-8 11:10

我来了~~~~~~~~~ 闪人~~~~~~~~~~~~~~~~  

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作者: IPS干细胞    时间: 2018-11-15 13:27

哦...............  

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作者: 榴榴莲    时间: 2018-11-19 05:14

声明一下：本人看贴和回贴的规则，好贴必看，精华贴必回。  

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作者: 小倔驴    时间: 2018-12-7 21:03

哈哈,有意思~顶顶 ，继续顶顶。继续顶哦  

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作者: laoli1999    时间: 2018-12-8 14:55

肿瘤干细胞

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