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标题: 人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制 [打印本页]

作者: 文献管理员 时间: 2009-3-3 12:35 标题: 人骨髓间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制

作者：白海，司志刚，王存邦，薛智文，吴涛，杨小亮作者单位：(兰州军区兰州总医院血液科，全军血液病中心，甘肃兰州 730050)
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      【摘要】  目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）体外对异体外周血T淋巴细胞的抑制作用及机制. 方法：从骨髓中分离培养MSCs，反复贴壁进行纯化；用尼龙棉柱法纯化异体外周血T淋巴细胞；观察MSCs对植物血凝素（PHA）刺激下T淋巴细胞增殖的影响，用ELISA方法检测IFNγ，IL4水平变化. 结果：  MSCs对PHA诱导的T淋巴细胞增殖有抑制作用，并呈剂量依赖性；同时MSCs亦可抑制T淋巴细胞的IFNγ分泌，但可促进IL4的分泌. 结论： MSCs对异体外周血T淋巴细胞的增殖有抑制作用，其作用可能与其影响T淋巴细胞分泌IFNγ和IL4有关. # V9 Z% T  O( Z, j
      【关键词】骨髓间充质干细胞；T淋巴细胞；免疫调节；干扰素γ；白细胞介素4
   0引言

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中不同于造血干细胞的另一类成体干细胞，这类细胞易于采集、分离和体外扩增，除具有高度增殖及多向分化潜能、促进机体造血重建外，还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植排斥等免疫调节作用，但具体机制还不清楚. 为进一步探讨MSCs的免疫调节功能，我们研究了MSCs对T淋巴细胞增殖及其分泌IFNγ与IL4的影响.
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1材料和方法& I  t1 ~! }8 p; A/ v0 H
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1.1骨髓MSCs的分离、培养与鉴定抽取肝素抗凝的健康供者骨髓20 mL（n=10），DMEM（Gibco）倍比稀释，Ficoll分离液（天津灏洋）2000 r/min,15 min条件下分离出单个核细胞，DMEM洗涤2次，完全培养基（100 g/L胎牛血清  DMEM）重悬细胞，以2109/L接种于25 cm2培养瓶内，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，24 h首次换液，以后每2～3 d换液1次，细胞融合度达80%时消化传代培养，流式细胞仪分析检测传至3代MSCs的纯度.
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1.2外周血T淋巴细胞的分离与纯度鉴定取新鲜肝素抗凝人外周血20 mL，Ficoll分离液（2000 r/min,15 min）分离出单个核细胞，尼龙棉柱法进一步分选T淋巴细胞，流式细胞仪分析尼龙棉柱分离前后T淋巴细胞的纯度.: v! T# y; b! R+ P4 L1 k4 w: s- G

1.3MSCs对植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）作用下的T淋巴细胞增殖的影响取第3代培养的MSCs，经60Co照射30 Gy，调整细胞密度，按细胞数分为3组，A组1103个，B组1104个，C组1105个，每组设单独同等数量MSCs为空白对照，以单独T淋巴细胞培养为阳性对照. 以终体积100 μL／孔，加入96孔培养板内，MSCs完全贴壁后吸去上清或更换培养液，并除空白对照外各组加入T淋巴细胞1104/孔. 经PHA 5 μg（Sigma）作用68 h后加入20 μL／孔MTT（Sigma）继续孵育4 h，弃上清后二甲基亚砜固定，酶标仪490 nm处测定A值，增殖百分率=（实验组A值-对照组A值）/实验组A值." b4 t* |% v+ Z+ m: R; t
) n" @1 V; w+ v  C  G$ x6 k' Z
1.4MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞IFNγ，IL4分泌的影响分别用1107/L，1108/L MSCs与1109/L的T淋巴细胞共培养，同时加入5 μg 的PHA. 应用IFNγ，IL4试剂盒（武汉博士德）检测各组培养上清中IFNγ和IL4浓度.9 i+ C, `$ {0 d- v0 P8 F1 \$ Q
* G! a; M5 c3 F4 {
统计学处理：应用SPSS软件进行统计分析，实验结果用x±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnettt检验，P

2结果
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2.1MSCs与T淋巴细胞纯度鉴定原代MSCs形态均匀一致，呈长梭形，流式细胞仪结果显示：传至3代MSCs高表达CD29，CD44和CD13，而CD34，CD45，HLADR低或极低表达，纯度达90%以上；异体外周血单个核细胞经尼龙棉柱分离后CD3 细胞百分比达98%以上.  ]7 J+ c+ y- o$ N% Q

2.2MSCs抑制T淋巴细胞的增殖MSCs对PHA刺激下的T淋巴细胞增殖呈抑制效应，并呈剂量依赖性. 单纯RPMI1640培养基条件下，T淋巴细胞阳性对照组的增殖率为（77.05±1.94）%，A，B，C组依次为（44.94±5.84）%，（33.45±7.00）%，（17.64±4.59）%，与阳性对照组比较均有统计学差异（P
9 V2 s/ \8 N3 f* V4 c3 s
2.3MSCs抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IFNγ为（79.16±13.40）ng/L，与1107/L，1108/L的MSCs共培养时IFNγ的分泌分别为（25.54±7.05），（9.55±3.60）ng/L，IFNγ分泌明显减少（P0 o4 |% B+ g  ]
( G/ X$ _* j2 U3 s
2.4MSCs促进T淋巴细胞IL4的分泌在单纯培养条件下，T淋巴细胞在PHA刺激下其上清分泌IL4的量为（46.04±9.67）ng/L，加入1107/L，1108/L MSCs后，IL4的分泌增加，分别为（67.10±11.44），（97.92±19.48）ng/L，与单纯T淋巴细胞培养组比较差异具有统计学意义（P& G# K7 k) f4 ]" C; X& J

3讨论
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MSCs是骨髓中的一类成体干细胞，是造血微环境的主要细胞成分，能分泌多种细胞因子，在维持造血微环境的稳定中起重要作用［1］. 在特定条件下具有向脂肪细胞、成纤维细胞、成骨细胞等多系分化的能力［2］. 目前研究发现，骨髓MSCs还具有免疫负调节和降低移植物抗宿主疾病(graftversushost disease, GVHD)的作用［3-4］. 小鼠的移植实验及临床的I，II期研究均发现，骨髓MSCs与造血干细胞共输注可以降低异基因造血干细胞植入引起的GVHD. Bartholomew等［5］将体外扩增的供者MSCs输注给行皮肤移植的狒狒体内，结果是皮肤移植物被排斥时间明显延长,提示MSCs具有免疫负调节能力. 并且骨髓MSCs低表达或不表达MHC II(HLADR), B7, CD40和CD40L，说明MSCs可能不具免疫原性，自身不引起T细胞的识别而产生免疫排斥［3］，为进一步临床应用提供了可能.  @1 L" G$ P3 ?+ ?# t9 L' `
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我们的实验结果亦表明MSCs能抑制PHA诱导的异体T淋巴细胞的增殖反应，并且其抑制作用与MSCs的细胞数量有关，呈细胞数量依赖性，与报道一致［3］. MSCs对T淋巴细胞增殖抑制作用的机制尚不清楚. 有学者指出，MSCs发挥免疫抑制效应无需抗原递呈细胞或CD4 CD25 调节性T细胞参与［6］，提示细胞间的直接接触是MSCs发挥抑制效应的重要环节；MSCs在体外培养条件下能分泌多种可溶性细胞因子，如TGFβ，HGF，可能是介导MSCs免疫调节作用的重要因子［7］，为了解MSCs对T淋巴细胞分泌细胞因子的影响，我们检测了MSCs作用下T细胞培养上清中IFNγ和IL4的变化，结果表明MSCs可抑制T淋巴细胞IFNγ的分泌，而促进IL4的分泌，并且在本检测条件下，MSCs对这二类细胞因子的影响具有一定的MSCs细胞浓度依赖性. 已知IFNγ是Thl细胞免疫正调节因子，而IL4主要由Th2细胞分泌的细胞因子. 结果说明MSCs可能以抑制Thl, 增强Th2的功能为主. 在异基因造血干细胞移植后GVHD发生的病理生理过程中，除了直接由T细胞介导的细胞毒作用外，大量的炎性细胞因子如白细胞介素(IL)，肿瘤坏死因子(TNF)，干扰素(IFN)等参与了GVHD的发生发展. 特别是在急性GVHD中，IFNγ是关键调节因子，在促使单核巨噬细胞产生大量IL1和TNFα中起重要作用［8］，因此，T细胞分泌IFNγ的减低，可以消减GVHD发生发展中免疫应答和“细胞因子风暴”的恶性循环，降低GVHD发生. 有证据表明，IL12，IL4对Thl和Th2细胞的分化启动和进一步发展起着主要作用［9］. Th2细胞分化的最主要决定因素是IL4. 此外，IL4对Th2细胞的增殖、基因转录以及抗凋亡也起着十分重要的作用，从而可减低GVHD和移植物排斥的发生. 所以MSCs体外抑制T细胞增殖并减少T细胞IFNγ的分泌, 增加IL4的分泌,可能是MSCs体内预防和减轻GVHD的机制.+ k2 K' N0 G; e6 B
      【参考文献】- ?4 B) H7 |1 f: z% w+ [- i2 l
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作者: kikiaaron 时间: 2010-3-23 15:12

不错！

作者: 科研人 时间: 2015-5-25 07:21

今天再看下

作者: biobio 时间: 2015-6-9 15:59

不错啊! 一个字牛啊!

作者: beautylive 时间: 2015-6-10 21:10

都是那么过来的

作者: 龙水生 时间: 2015-7-5 09:34

先看看怎么样！

作者: 榴榴莲 时间: 2015-8-1 17:28

帮你项项吧

作者: 兔兔 时间: 2015-8-5 19:32

今天的干细胞研究资料更新很多呀

作者: 罗马星空 时间: 2015-8-24 10:01

你加油吧

作者: bluesuns 时间: 2015-9-10 11:27

细胞治疗行业

作者: 我心飞翔 时间: 2015-9-12 19:10

ips是诱导多能干细胞induced pluripotent stem cells iPS

作者: 榴榴莲 时间: 2015-9-14 01:49

楼上的稍等啦

作者: 昕昕 时间: 2015-9-28 02:13

肿瘤干细胞

作者: beautylive 时间: 2015-10-25 15:18

顶．支持，路过．．．．．

作者: txxxtyq 时间: 2015-11-5 12:34

谢谢分享了!

作者: txxxtyq 时间: 2015-11-14 20:13

胚胎干细胞

作者: 123456zsz 时间: 2015-11-29 14:18

干细胞美容

作者: awen 时间: 2015-12-15 19:27

我也来顶一下..

作者: 石头111 时间: 2016-1-15 22:17

支持一下吧

作者: txxxtyq 时间: 2016-1-18 18:48

不错，感谢楼主

作者: s06806 时间: 2016-1-29 21:27

我卷了~~~~~~~

作者: 杏花 时间: 2016-3-10 17:10

宁愿选择放弃，不要放弃选择。

作者: syt7000 时间: 2016-3-15 19:00

挤在北京，给首都添麻烦了……

作者: nauticus 时间: 2016-3-29 16:47

不错啊! 一个字牛啊!

作者: 化药所 时间: 2016-4-27 17:25

淋巴细胞

作者: 小倔驴 时间: 2016-5-19 21:42

要不我崇拜你?行吗?

作者: syt7000 时间: 2016-5-22 20:33

免疫细胞治疗

作者: 甘泉 时间: 2016-6-27 09:35

原来这样也可以

作者: biopxl 时间: 2016-7-21 16:01

我喜欢这个贴子

作者: dypnr 时间: 2016-9-26 07:42

赚点分不容易啊

作者: 小小C 时间: 2016-10-4 15:27

这贴？不回都不行啊

作者: dogcat 时间: 2016-10-28 10:43

老大,我好崇拜你哟

作者: xm19 时间: 2016-10-28 14:10

希望可以用些时间了~````

作者: 老农爱科学 时间: 2016-10-31 11:27

希望大家都有好运

作者: aakkaa 时间: 2016-11-8 12:43

好啊，，不错、、、、

作者: s06806 时间: 2016-12-31 19:27

干细胞与基因技术

作者: 老农爱科学 时间: 2017-1-1 19:21

既然来了，就留个脚印

作者: lab2010 时间: 2017-1-13 17:36

祝干细胞之家越办越好~~~~~~~~~`

作者: immail 时间: 2017-1-31 01:34

这贴？不回都不行啊

作者: 王者之道 时间: 2017-2-7 17:27

神经干细胞

作者: sshang 时间: 2017-2-8 01:12

呵呵哪天得看看 `~~~~

作者: 墨玉 时间: 2017-2-9 18:42

初来乍到，请多多关照。。。

作者: 蚂蚁 时间: 2017-2-11 12:25

不是吧

作者: 坛中酒 时间: 2017-2-22 20:26

家财万贯还得回很多贴哦

作者: tuanzi 时间: 2017-4-7 18:35

感謝樓主干细胞之家真的不错

作者: dongmei 时间: 2017-4-8 15:47

好困啊

作者: keanuc 时间: 2017-4-10 23:52

站个位在说

作者: renee 时间: 2017-4-28 01:39

不对，就是碗是铁的，里边没饭你吃啥去？

作者: tempo 时间: 2017-4-30 14:54

每天都会来干细胞之家看看

作者: 命运的宠儿 时间: 2017-4-30 23:43

围观来了哦

作者: biobio 时间: 2017-5-12 00:41

每天都会来干细胞之家看看

作者: 123456zsz 时间: 2017-5-24 08:43

楼主也是博士后吗

作者: 红旗 时间: 2017-5-27 14:35

呵呵那就好好玩吧~~~~

作者: 考拉 时间: 2017-6-7 13:17

不是吧

作者: 草长莺飞 时间: 2017-7-9 17:35

谢谢分享了!

作者: 橙味绿茶 时间: 2017-7-14 11:02

看贴回复是好习惯

作者: 温暖暖 时间: 2017-7-14 12:01

哈哈，看的人少，回一下

作者: bioprotein 时间: 2017-7-15 18:35

脂肪干细胞

作者: 8666sea 时间: 2017-7-26 07:18

祝干细胞之家越办越好~~~~~~~~~`

作者: renee 时间: 2017-7-28 15:09

我好想升级

作者: 20130827 时间: 2017-8-26 04:15

太棒了！

作者: 天蓝色 时间: 2017-8-27 22:50

哈哈，看的人少，回一下

作者: 三星 时间: 2017-8-28 01:30

顶的就是你

作者: SCISCI 时间: 2017-9-5 08:02

也许似乎大概是，然而未必不见得。

作者: htc728 时间: 2017-9-7 10:27

干细胞研究还要面向临床

作者: Diary 时间: 2017-9-23 19:01

希望可以用些时间了~````

作者: 安安 时间: 2017-9-29 08:19

谢谢分享了!

作者: 我心飞翔 时间: 2017-10-13 21:09

顶顶更健康，越顶吃的越香。

作者: 知足常乐 时间: 2017-10-27 17:43

自己知道了

作者: 若天涯 时间: 2017-11-21 10:55

顶．支持，路过．．．．．

作者: whyboy 时间: 2017-12-19 08:35

努力,努力,再努力!!!!!!!!!!!

作者: 我心飞翔 时间: 2017-12-20 03:32

羊水干细胞

作者: 张佳 时间: 2017-12-20 06:05

不错不错比我强多了

作者: bluesuns 时间: 2017-12-21 11:54

感謝樓主干细胞之家真的不错

作者: whyboy 时间: 2018-1-17 17:18

应该加分

作者: pengzy 时间: 2018-1-22 03:44

在线等在线等

作者: tempo 时间: 2018-2-12 11:01

干细胞之家我永远支持

作者: 知足常乐 时间: 2018-2-28 18:32

我想要`~

作者: aliyun 时间: 2018-3-12 06:02

干细胞研究还要面向临床

作者: wq90 时间: 2018-3-28 00:29

生殖干细胞

作者: biobio 时间: 2018-4-15 04:28

每天早上起床都要看一遍“福布斯”富翁排行榜，如果上面没有我的名字，我就去上班……

作者: 生科院 时间: 2018-4-17 19:53

肿瘤干细胞

作者: 小丑的哭泣 时间: 2018-4-20 23:14

支持~~顶顶~~~

作者: Kuo 时间: 2018-5-30 13:01

回复一下

作者: 快乐小郎 时间: 2018-6-4 15:18

好贴坏贴，一眼就看出去

作者: ikiss 时间: 2018-6-5 15:34

好啊，谢楼主

作者: 甘泉 时间: 2018-6-16 14:10

真是汗啊我的家财好少啊加油

作者: 王者之道 时间: 2018-6-16 19:13

我是来收集资料滴...

作者: dongmei 时间: 2018-7-3 06:40

生殖干细胞

作者: htc728 时间: 2018-8-14 08:18

好帖子，要顶！

作者: na602 时间: 2018-8-16 09:10

干细胞之家是不错的网站

作者: 加菲猫 时间: 2018-8-18 05:10

干细胞治疗糖尿病

作者: 某某人 时间: 2018-8-21 16:43

牛牛牛牛

作者: 水木清华 时间: 2018-10-3 09:35

楼主good

作者: dr_ji 时间: 2018-10-12 07:42

真是天底下好事多多

作者: hmhy 时间: 2018-10-16 06:07

免疫细胞治疗

作者: DAIMAND 时间: 2018-10-20 02:34

今天临床的资料更新很多呀

作者: beautylive 时间: 2018-11-29 20:04

dc-cik nk

作者: 三好学生 时间: 2018-12-14 07:35

哈哈，看的人少，回一下

作者: 舒思 时间: 2019-1-12 06:54

支持你就顶你

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