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标题: 神经干细胞移植对大鼠视神经损伤后节细胞的保护作用 [打印本页]

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作者: 文献管理员    时间: 2009-3-3 12:35     标题: 神经干细胞移植对大鼠视神经损伤后节细胞的保护作用

作者：柳浩然 杨长虹 高俊玮作者单位：中南大学湘雅医院神经外科，  湖南  长沙  410008 * S9 u2 @6 w+ q! X6 Y6 N$ u
                  , w2 N# @" ]+ Y4 Q( Z# Z4 ]. ?8 ^
                  
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9 \! [1 R$ D( ]1 }2 l0 E' b6 O                        
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3 C' A& M# V! @( a2 x. z        ' }  f4 }# P& n& y( ~6 h/ k. W$ }, y. D5 G
          【摘要】  目的  探讨神经干细胞 （NSCs） 移植对视神经受损SD大鼠视网膜节细胞 （RGCs） 的保护作用。  方法  将48只健康成年SD大鼠随机分为N组 （NSCs移植组） 和C组 （对照组），均使用精确校准方法在右眼造成部分视神经损伤，左眼作为正常对照。从胚胎SD大鼠海马分离NSCs，利用细胞培养和体内移植技术，将培养后的NSCs注入N 组大鼠右眼玻璃体内，C组大鼠右眼玻璃体内注入同等体积的PBS，处死前3 d在双上丘注射3%快蓝逆行标记双眼RGCs。将大鼠分别于注射NSCs或PBS后7 d、14 d、21 d、28 d处死，各分为4组，每组6只，分离视网膜置于荧光显微镜下，摄影输入计算机图像分析仪计数RGC，计算RGC标识率。另取6只健康成年SD大鼠作NSCs移植，分别于移植后7 d、28 d处死，每时间段3只，通过视网膜免疫荧光切片观察NSCs在视网膜的存活、整合情况。  结果  N组大鼠各时间段RGCs标识率与C组同时间段比较均增高，有显著性差异 （P
+ a( U* P' _* J4 Y1 q6 g$ y* I          【关键词】干细胞移植 视神经损伤 视网膜神经节细胞 大鼠 Sprague-Dawley
& C9 [2 g5 c; G/ i" g4 R8 v                  Protective effect of neural stem cell transplantation on retinal ganglion cells) r' ]! E3 r+ I2 D% G. O9 P. e4 a$ \7 I

1 [& j2 x9 D" p; _8 Q/ Mof rats with optic nerve injury+ s% U: v# Q2 V

4 @6 w* P' c& b( k" t, r! ?3 P, tLIU Haoran1, YANG Changhong2, GAO Junwei1, et al
7 [) W8 I/ R- X8 ]8 o3 @# }
# F+ `9 {; U1 E; Y' K9 H  U+ b0 D1. Department of Neurosurgery, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410008, China; 2. Department of Neurosurgery, Hospital for Guangdong Frontier General Team, Chinese People's Armed Police Forces, Shenzhen 518029, China
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Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of neural stem cell (NSC) transplantation on retinal ganglion cells (RGCs) ofSprague-Dawley rats with optic nerve injury.MethodsForty-eight adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into group N (NSC) and group C (control). Optic nerve crush injury was induced in the right eyes by a calibrated method, and the left eyes served as the normal control. NSCs were taken from embryonic SD rat hippocampus and cultured in vitro and grafted in vivo. NSCs were injected into the vitreous body of right eyes of rats in group N. Rats in group C were injected with isovolumetric PBS. Three days before sacrifice, 3% fast blue was injected into the superior colliculi bilaterally. According to the time interval between the optic nerve crush and sacrifice, both group N and C were divided respectively into four subgroups (day 7, day 14, day 21 and day 28) with 6 rats in each one. The eyes were enucleated after the rat was sacrificed, and flat mounts of the retina from both eyes were observed under a fluorescence microscope. The labeled RGCs were counted by a computerized image analyzer. The label rate of RGCs was calculated for statistical analysis. In addition, 6 adult SD rats were treated as group N, and sacrificed on days 7 and 28 after transplantation with 3 rats each time. Survival and integration of grafted NSCs in the retina of the host animals were detected by the immunofluorescence technique.ResultsThe label rate of RGCs in group N was significantly higher than that in group C at each time period (P8 L' x( Z' Y& ?6 p$ }5 y

( x7 c6 {2 R: j, W" W; DKey words:stem cell transplantation;optic nerve injuries;retinal ganglion cells;rats, Sprague-Dawley) D3 S: R7 Y; l' r  Y: N
" S& R3 S  B) Q: Z
本实验取胚鼠神经干细胞 （NSCs） 体外培养后植入视神经损伤SD大鼠视网膜内，在不同时间段观察神经节细胞的变化，以探讨NSCs移植对神经节细胞修复的影响。4 @1 p; W- z. G: c7 K
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1材料与方法
) J. G  X! @& L0 v1 c" M: N( ^6 w1 t) {' {0 y. O: J  p6 `4 w
1.1实验动物及分组选用48只健康成年SD大鼠，月龄2～3个月，雌雄不限，体质量300～350 g。制作视神经损伤模型后，按随机数字表法分为N组 （NSCs移植组） 和C组 （对照组），各24只，分别于注射NSCs或PBS后7 d、14 d、21 d、28 d各处死6只，作视网膜铺片及视网膜节细胞 （RGCs） 计数。另取6只SD大鼠制作视神经损伤模型后，玻璃体下腔注射定量NSCs，分别于移植后7 d、28 d各处死3只，取视网膜作免疫荧光切片。
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1.2实验方法7 O& c" C, N0 J0 ^6 r

4 \2 v9 u0 H7 i1.2.1精确校准方法制作右眼部分视神经损伤模型：3%戊巴比妥钠 （30 mg/kg） 腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧固定于手术台上，在双目手术显微镜下，于右侧睑缘中线处垂直剪开上睑、球结膜及部分穹窿结膜，将内直肌、上直肌钝性向后分离，暴露视神经，用头端宽1 mm的微型动脉夹在球后2~3 mm处夹持视神经6 s造成视神经损伤，此时可见瞳孔逐渐散大。分层缝合结膜及眼睑。" C7 m% R( j. W1 P8 d, L" L! U+ \% h' }7 r

5 W8 F* Q1 H- K1.2.2NSCs分离、培养：按高俊玮等[1]报道的方法进行。+ I/ N6 y0 I+ S! R7 \% |" h

9 C. S4 }! J, R0 t  a1 A1.2.3移植细胞标记：NSCs移植前48 h，培养液中加入5-溴脱氧尿核苷 （BrdU），调整终浓度为10 μmol/L，抽样测定阳性标记率。
% B5 u. j( M  F: r, ^4 `- N) H
4 f( ~4 m# I! A$ }1.2.4细胞移植：收集标记的NSCs球，用D-Hank液洗3次后移至0.5 ml EP管内，再次离心后去上清，加入不含表皮生长因子 （EGF） 和碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 的DMEM/F12基础培养液重悬细胞，调整细胞浓度为5  104个/μl，移植前始终置于冰上进行保护。腹腔注射戊巴比妥钠 （30 mg/kg） 麻醉N 组大鼠，在手术显微镜下，将微玻管从大鼠右侧眼球的巩膜角膜缘处插入玻璃体腔内，抽出约1.5 μl玻璃体液，随即慢慢注入等量NSCs悬液。C组大鼠采用同样方法注入等量PBS。
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9 q, d! X$ h1 T0 Y$ y1.2.5视网膜节细胞逆行标记：大鼠处死前3 d，手术暴露大鼠矢状缝和人字缝，根据大鼠脑立体定位图谱确定双上丘的颅骨表面投影，在距前囟后方6.3 mm和6.8 mm处钻孔，用微量注射器将3%快蓝缓慢、均匀地注入双上丘，标记双眼并计数节细胞，剂量为每点0.5 μl，深度4.1 mm和4 mm，留针3 min后缓慢退针[2]。/ m: l! G4 {/ q/ q/ r/ h( T

' G& c& s- k. V* R, d5 V* H5 Y1.2.6视网膜铺片及RGCs计数：大鼠处死前经心脏灌注0.1 mol/L PBS和40 g/L多聚甲醛固定，处死后分离视网膜，并于3、6、9、12点方位剪开视网膜，玻璃体一侧朝上将视网膜铺片，400倍荧光显微镜下观察，在视网膜铺片4个象限内 （颞上、颞下、鼻上、鼻下象限），距视乳头中心1 mm、2 mm、3 mm处进行荧光拍照，将12张照片输入计算机，采用图像分析仪计数，将每只眼12处RGCs相加，计数每只大鼠的标识率，即损伤眼RGC/未损伤眼RGC  100%。  D8 K- F6 T- `% B

# W2 ~' c, t: U6 T( [' }1.2.7视网膜免疫荧光切片观察NSCs在视网膜内的存活、整合与分化：另取NSCs移植后7 d及28 d SD鼠各3只，在深度麻醉下开胸，经左心室快速灌注灭菌生理盐水40 ml冲洗血液，随即灌注0.1 mol/L PBS配制的4%多聚甲醛液200 ml，取眼球，去除角膜和晶状体，置于0.1 mol/L PBS和40 g/L多聚甲醛中固定2 h。30%蔗糖 （0.1 mol/L PBS） 过夜。矢状位切片，片厚20 μm，明胶片贴片。切片自然干燥后，进行免疫荧光标记。一抗为抗BrdU、兔抗突触囊泡膜蛋白 （synaptophysin，SYN），二抗为Cy3标记的山羊抗小鼠IgG及FITC标记的山羊抗大鼠IgG，浓度均为1∶200。具体操作过程如下：切片用0.05 mmol/L PBS （含0.03% Triton X-100） 漂洗5 min  3，正常山羊血清封闭30 min，一抗孵育4 ℃过夜，0.05 mol/L PBS漂洗5 min  3，二抗37 ℃温育30 min，0.05 mol/L PBS漂洗5 min  3，自然干燥，水溶性风片剂封片。BX50荧光显微镜下观察，图像处理软件为HMIAS-2000。8 Q( J1 i* T. a8 J( U( K0 j
8 b, e: T3 u, Q1 \' Q6 O6 o1 P
1.3统计学分析采用SPSS10.0 统计软件进行分析，样本均数采用x ± s表示，均数间比较采用t检验。
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$ p5 B: o# o3 j$ s% d2结果8 K. f& [: q$ g5 O- e+ w

+ K2 j5 A- C/ h* w: T" |* B0 z) U; |2.1视网膜RGCs形态观察NSCs移植或PBS注射1周后，荧光显微镜下可见RGCs形态多样，细胞质呈蓝色，可见许多突起；NSCs移植组RGCs数目明显多于PBS组 （图1，2）。6 F, J/ A' h; l9 w0 R
: D. @+ {$ K! S  ^' L* P
2.2RGCs计数及标识率 （表1）由此可见视神经损伤眼RGCs计数均明显低于未损伤眼 （P ＜0.01）；随时间的延长，两组神经节细胞标识率均呈下降趋势，组内前后时间段比较均有显著性差异 （P ＜0.01），但N组下降幅度明显较C组平缓。同时间段N组RGCs标识率均高于C组，且差异具有统计学意义 （P ＜0.01）。( V- g6 U5 B  y
& K) d# b. @  m: V
2.3神经干细胞在宿主视网膜内的存活、整合NSCs移植7 d后，在SD大鼠眼内，移植的NSCs广泛分布于RGCs表面 （图3），视网膜横切面上，可见部分移植的NSCs迁移至视网膜的节细胞层和内网层，但外观上呈未成熟状态，BrdU免疫标记阳性。4 q- x; {4 ?$ ^" q; o3 S- S+ }

( E! I& ~5 S9 \NSCs移植28 d后，在所有SD大鼠视网膜内，可见NSCs广泛整合于宿主视网膜内 （图4），大部分位于节细胞层，其突起非常丰富，伸入内网层；少部分位于内网层，靠近节细胞层或内核层，突起呈横或纵向走行，参与内网层形成；个别细胞到达内核层。
! a1 F( b* D% W. r9 C- d% H! G- L. ]# J3 h, J
3讨论
& Y2 d# F% v0 i7 Z3 i5 }; c; m! v# F& v
本实验对大鼠NSCs移植后7、14、21及28 d分别进行RGCs计数，发现随时间延长，神经节细胞逐渐减少，但与对照组比较降低幅度明显平缓，说明NSCs移植可减缓节细胞凋亡，挽救受损但尚未溃变的细胞。项平等[3]移植骨髓间质干细胞至视神经损伤鼠视网膜内，发现干细胞移植组节细胞数量明显高于注射PBS组，与本实验观察结果类似，说明NSCs可能对节细胞存在一定保护作用。Wang等[4]在研究青光眼小鼠模型中发现：NSCs视网膜移植不能减缓受损节细胞的凋亡。Brustle等[5]认为：细胞移植后的存活、迁移、分化及生物活性与局部环境密切相关。与本研究结果存在差异，推测可能与体内微环境的差异影响了NSCs的活性有关，也可能与NSCs对损伤节细胞的修复有关，其原因仍有待进一步探讨。在RGCs生命周期中，持续的神经营养因子供应是维持其正常功能的保证。新生Wistar鼠在去除上丘或切断视神经轴突后，神经营养因子的轴浆运输被阻断，导致RGCs迅速凋亡[6]。Lu等[7]发现将NSCs移植入脊髓损伤小鼠模型中可显著促进轴突再生，检测体外培养及植入脊髓中的NSCs，发现两者均可分泌神经营养因子，包括胶质细胞源性神经营养因子 （GDNF）、脑源性神经营养因子 （BDNF）、神经生长因子 （NGF） 等，因此推测NSCs是通过分泌神经营养因子促进轴突再生的，而不是直接替代损伤的脊髓。Young等[8]发现：将海马干细胞移植入视神经退行性变小鼠模型视网膜中，NSCs在移植4周时可很好地与视网膜整合，部分甚至到达外颗粒层及外膜层，但未发现NSCs可分化表达节细胞的标记物，表明NSCs不能分化为神经节细胞。已有较多研究证实：BDNF、bFGF、睫状神经营养因子 （CNTF） 等神经营养因子对神经节细胞有确切的保护作用[9~11]；结合本实验结果推测：NSCs很可能通过分泌神经营养因子，间接发挥保护节细胞的作用。
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本研究结果发现：NSCs移植7 d后，部分移植细胞迁移至视网膜的内网层和节细胞层，BrdU免疫标记呈阳性；28 d后可见移植细胞广泛整合至宿主视网膜内，但大部分移植细胞胞体位于节细胞层，少部分位于内网层及内核层，突起呈横或纵向走行，参与内网层形成，说明移植细胞向视网膜深层迁移，且可与视网膜建立结构形态上的联系。与视网膜融合的部分NSCs能表达神经元及神经胶质细胞标记物，说明移植细胞不仅能在视网膜内广泛整合，而且还能向神经元或胶质细胞样分化。Guo等[12]发现：在视网膜缺血损伤的大鼠动物模型中，玻璃体内移植的海马源性NSCs能迁移整合至受损的视网膜内，部分细胞向神经元分化。Young等[8]在视网膜退行性变的小鼠模型中发现：将NSCs行玻璃体下腔移植，可见其广泛与视网膜全层融合并分化为神经元，且部分神经元有轴突样改变。将神经干细胞球直接移植到色素性视网膜炎小鼠眼内，也可观察到NSCs在视网膜内向神经元分化[13]。推测在视神经损伤的特殊环境内，神经胶质细胞或残存的神经元可能重新分泌一些信号分子，如神经营养因子等, 并诱导其受体表达上调[14]，从而指导NSCs迁移和诱导其向神经元分化，迁移及分化后的NSCs与视网膜有着形态结构上的联系，从而为NSCs对受损节细胞的保护作用奠定了基础。! v- S9 K$ V8 U

  M& X" c1 j% U% l( h. |7 h) E: v: m* X近年来，Wang等[4]及Lu等[7]发现：神经营养因子转基因 （如BDNF、NT-3等） NSCs在体内、外均可分泌一定的神经营养因子，有利于神经损伤的再生及神经元的修复。因此，探讨NSCs及转基因NSCs移植对视神经损伤节细胞再生的影响，将可能为视神经损伤的治疗提供崭新的策略。. e# R3 n: Z0 S' P8 f  h

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作者: 陈晴    时间: 2015-5-31 22:27

顶你一下，好贴要顶！  

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作者: laoli1999    时间: 2015-6-14 00:11

观看中  

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作者: 杏花    时间: 2015-6-23 08:43

你还想说什么啊....  

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作者: 兔兔    时间: 2015-7-6 14:27

支持你就顶你  

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作者: dypnr    时间: 2015-7-27 17:01

胚胎干细胞

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作者: 龙水生    时间: 2015-7-29 21:42

干细胞与动物克隆

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作者: 命运的宠儿    时间: 2015-8-11 08:18

快毕业了 希望有个好工作 干细胞还是不错的方向

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作者: bluesuns    时间: 2015-8-13 17:26

其实回帖算是一种没德德，所以我快成圣人了  

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作者: txxxtyq    时间: 2015-8-31 21:01

怎么就没人拜我为偶像那?? ~  

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作者: 我心飞翔    时间: 2015-9-19 17:25

今天临床的资料更新很多呀

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作者: sky蓝    时间: 2015-9-28 17:01

努力,努力,再努力!!!!!!!!!!!  

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作者: MIYAGI    时间: 2015-11-8 15:47

是楼主原创吗  

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作者: immail    时间: 2015-11-19 20:40

支持一下吧  

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作者: MIYAGI    时间: 2015-11-23 14:43

这个贴不错！！！！！看了之后就要回复贴子，呵呵  

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作者: nauticus    时间: 2015-12-6 11:27

皮肤干细胞

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作者: tempo    时间: 2015-12-17 10:34

…没我说话的余地…飘走  

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作者: beautylive    时间: 2015-12-31 14:39

佩服佩服啊.  

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作者: 张佳    时间: 2016-1-4 21:27

哈哈 瞧你说的~~~  

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作者: 依旧随遇而安    时间: 2016-1-10 11:16

哈哈,有意思~顶顶 ，继续顶顶。继续顶哦  

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作者: 龙水生    时间: 2016-1-24 08:40

哦...............  

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作者: marysyq    时间: 2016-2-1 12:15

人之所以能，是相信能。  

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作者: 狂奔的蜗牛    时间: 2016-2-15 15:18

想都不想，就支持一下  

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作者: tuting    时间: 2016-3-2 17:59

干细胞疾病模型

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作者: htc728    时间: 2016-3-25 14:18

支持一下吧  

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作者: sshang    时间: 2016-3-27 22:09

看或者不看，贴子就在这里，不急不忙  

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作者: 我学故我思    时间: 2016-4-6 16:24

呵呵 哪天得看看 `~~~~  

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作者: bluesuns    时间: 2016-5-21 17:13

我毫不犹豫地把楼主的这个帖子收藏了  

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作者: 初夏洒脱    时间: 2016-6-7 21:34

写得好啊  

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作者: haha3245    时间: 2016-6-15 19:35

造血干细胞

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作者: bioprotein    时间: 2016-6-28 17:06

先顶后看  

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作者: xiao2014    时间: 2016-7-11 10:54

慢慢来，呵呵  

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作者: mk990    时间: 2016-7-17 20:02

又看了一次  

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作者: tempo    时间: 2016-7-19 07:53

说嘛1~~~想说什么就说什么嘛~~  

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作者: 化药所    时间: 2016-8-4 21:42

这个站不错！！  

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作者: ringsing    时间: 2016-8-25 09:54

不早了 各位晚安~~~~  

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作者: 3344555    时间: 2016-9-12 09:54

今天再看下  

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作者: youngcell    时间: 2016-9-13 19:43

说的不错  

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作者: 锦锦乐道    时间: 2016-9-23 18:57

呵呵 高高实在是高~~~~~  

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作者: frogsays    时间: 2016-10-17 17:34

我来看看！谢谢  

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作者: txxxtyq    时间: 2016-11-2 13:10

(*^__^*) 嘻嘻……   

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作者: myylove    时间: 2016-11-2 20:18

正好你开咯这样的帖  

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作者: dataeook    时间: 2016-11-26 20:09

问渠哪得清如许，为有源头活水来。  

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作者: vsill    时间: 2016-12-4 22:23

努力,努力,再努力!!!!!!!!!!!  

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作者: xm19    时间: 2017-1-1 01:59

支持一下  

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作者: 123456zsz    时间: 2017-1-30 21:55

加油啊！！！！顶哦!!!!!支持楼主，支持你~  

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作者: syt7000    时间: 2017-2-18 08:35

人气还要再提高  

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作者: whyboy    时间: 2017-2-19 03:23

我来了~~~~~~~~~ 闪人~~~~~~~~~~~~~~~~  

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作者: 墨玉    时间: 2017-2-20 08:35

角膜缘上皮干细胞

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作者: 旅美学者    时间: 2017-3-1 22:33

皮肤干细胞

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作者: SCISCI    时间: 2017-3-5 03:15

干细胞与基因技术

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作者: 坛中酒    时间: 2017-3-10 02:39

回答了那么多，没有加分了，郁闷。。  

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作者: HongHong    时间: 2017-3-15 10:43

不错不错.,..我喜欢  

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作者: lalala    时间: 2017-3-19 15:10

肿瘤干细胞

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作者: 安生    时间: 2017-3-30 04:31

彪悍的人生不需要解释。  

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作者: 昕昕    时间: 2017-4-16 09:53

不错，支持下  

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作者: 咖啡功夫猫    时间: 2017-4-16 16:28

好啊，，不错、、、、  

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作者: 小小C    时间: 2017-4-19 03:15

加油啊！！！！顶哦!!!!!支持楼主，支持你~  

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作者: Diary    时间: 2017-4-21 23:27

哈哈，看的人少，回一下  

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作者: popobird    时间: 2017-4-27 09:42

支持一下  

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作者: 泡泡鱼    时间: 2017-4-29 20:14

支持~~  

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作者: 丸子    时间: 2017-5-1 04:36

人气还要再提高  

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作者: vsill    时间: 2017-5-18 14:34

也许似乎大概是，然而未必不见得。  

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作者: cjms    时间: 2017-5-25 14:43

偶啥时才能熬出头啊.  

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作者: 咕咚123    时间: 2017-5-31 04:47

一楼的位置好啊..  

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作者: bluesuns    时间: 2017-6-7 23:07

每天都会来干细胞之家看看

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作者: pcr    时间: 2017-6-17 18:34

呵呵 高高实在是高~~~~~  

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作者: 天蓝色    时间: 2017-6-22 07:35

一个子 没看懂  

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作者: haha3245    时间: 2017-7-10 12:02

不错的东西  持续关注  

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作者: vsill    时间: 2017-7-29 09:43

淋巴细胞

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作者: xm19    时间: 2017-8-3 16:41

不早了 各位晚安~~~~  

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作者: alwaysniu    时间: 2017-8-10 05:22

我是来收集资料滴...  

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作者: 生科院    时间: 2017-8-14 13:09

我等你哟!  

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作者: dr_ji    时间: 2017-8-20 14:34

哈哈，看的人少，回一下  

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作者: pengzy    时间: 2017-8-31 06:09

我的啦嘿嘿  

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作者: lab2010    时间: 2017-9-14 23:43

希望大家都有好运  

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作者: frogsays    时间: 2017-10-1 00:37

好帖，有才  

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作者: IPS干细胞    时间: 2017-10-5 15:10

今天的干细胞研究资料更新很多呀

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作者: 小小C    时间: 2017-10-11 08:43

一个人最大的破产是绝望，最大的资产是希望。  

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作者: awen    时间: 2017-10-19 09:18

感觉好像在哪里看过了，汗~  

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作者: Kuo    时间: 2017-10-21 15:18

免疫细胞治疗  

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作者: 杏花    时间: 2017-10-27 16:43

顶．支持，路过．．．．．  

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作者: hmhy    时间: 2017-10-31 14:52

厉害！强~~~~没的说了！  

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作者: 咖啡功夫猫    时间: 2017-11-1 15:27

间充质干细胞

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作者: tuanzi    时间: 2017-11-4 06:31

dddddddddddddd  

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作者: youngcell    时间: 2017-11-6 22:53

呵呵 都没人想我~~  

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作者: dd赤焰    时间: 2017-11-12 19:54

干细胞治疗  

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作者: abc987    时间: 2017-11-20 23:12

呵呵 大家好奇嘛 来观看下~~~~  

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作者: qibaobao    时间: 2017-11-23 10:11

应该加分  

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作者: beautylive    时间: 2017-12-1 17:35

很有吸引力  

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作者: 三好学生    时间: 2017-12-3 17:18

顶也～  

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作者: dglove    时间: 2017-12-26 18:46

帮你项项吧  

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作者: 与你同行    时间: 2018-1-3 09:10

谢谢干细胞之家提供资料

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作者: dr_ji    时间: 2018-1-5 01:30

来上茶~~~~  

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作者: happyboy    时间: 2018-1-5 13:35

天啊. 很好的资源

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作者: 老农爱科学    时间: 2018-1-18 08:26

哈哈,顶你了哦.  

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作者: 123456zsz    时间: 2018-1-29 15:27

不对，就是碗是铁的，里边没饭你吃啥去？  

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作者: myylove    时间: 2018-2-7 16:51

支持~~  

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作者: netlover    时间: 2018-2-16 03:45

今天再看下  

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作者: Kuo    时间: 2018-3-18 08:01

顶．支持，路过．．．．．  

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