作者：张卫泽，樊艳，陈永清，马凌，秦勉，哈小琴，韩娟萍作者单位：兰州军区兰州总医院： 心血管内科，医学实验中心，甘肃 兰州 730050， 兰州大学临床医学院内科学心血管病专业，甘肃 兰州 730000 . M( n1 R! s [6 l% b. s% S/ l
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【摘要】 目的： 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对成人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)向心肌细胞方向分化的诱导作用，并与5氮杂胞苷（5aza）作比较. 方法： 自成人脂肪组织中分离培养ADMSCs，分别用AngⅡ（Ⅰ组）和5aza（Ⅱ组）诱导ADMSCs，同时设立对照组（Ⅲ组），光镜下观察细胞的生长情况及形态学变化，电镜下观察细胞的超微结构，免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ），MTT法检测细胞活性，流式细胞术分析细胞周期及凋亡. 结果： Ⅰ,Ⅱ组ADMSCs诱导后呈现类似心肌细胞的形态学特征，第28日Ⅰ, Ⅱ组均表达cTnⅠ，两组间诱导转化率无差别，其中Ⅰ组ADMSCs增殖迅速，较少凋亡细胞. 结论： AngⅡ在促进ADMSCs增殖的同时诱导其向心肌细胞分化，优于传统的化学诱导剂5aza. " Q( U6 O- s/ w
【关键词】干细胞；脂肪组织；血管紧张素Ⅱ；5氮杂胞苷；心肌细胞；诱导分化 * h @4 y/ u+ @2 U+ p, j/ E Effect of Angiotensin Ⅱ on differentiation of adult adiposederived mesenchymal stem cells into myocardial cells( W4 _/ W: M& e2 A J
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ZHANG WeiZe, FAN Yan, CHEN YongQing, MA Ling, QIN Mian, HA XiaoQin, HAN JuanPing + U# \$ e7 s- v " S1 o* C5 |% g( R& k: |* N Department of Cardiology, 3Medical Experimental Center, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China, Angiocardiopathy Specialty, Clinical Medical School, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China ' ] V2 e n. g t: T, V- b" w. ?3 A2 ^, n1 i6 h6 t/ H
【Abstract】 AIM: To study the induction effect of angiotensin Ⅱ (AngⅡ) on the differentiation of adult adiposederived mesenchymal stem cells (ADMSCs) into myocardial cells, and to compare its effect with 5azacytidine (5aza). METHODS: ADMSCs were isolated and cultured from adult adipose tissue. AngⅡ (Group Ⅰ) and 5aza (Group Ⅱ) were added to induce ADMSCs, while control group (Group Ⅲ) was set up. Cell growth and morphological changes were observed with light microscope. Electron microscope was used to observe cell ultrastructure, while immunocytochemical methods was adopted to test cardiacspecific troponinⅠ (cTnⅠ). MTT was used to assay cell viability and flow cytometry was to analyze cell cycle and apoptosis. RESULTS: ADMSCs in Group Ⅰ and Group Ⅱ showed similar myocardial cells in morphological features. Twentyeight days after induction, ADMSCs in Group Ⅰ and Group II both expressed cTnⅠ, and induced conversion rate in these 2 groups had no discrimination. ADMSCs in Group Ⅰ had higher proliferation rate and lower apoptosis rate than those of Group Ⅱ. CONCLUSION: AngⅡ can not only promote ADMSCs proliferation but also induce differentiation to the direction of myocardial cells. Its effects is better than that of traditional chemical inducer 5aza.& N- A- Y8 u2 ~
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【Keywords】 stem cells; adipose tissue; angiotensin Ⅱ; 5azacytidine; myocardial cells; induced differentiation9 E( H* O( J. T
% t2 [) M f" Z5 ?. N5 W 0引言 * K/ C s" [& ]& s4 m 1 a; I% o0 J& `$ d6 L" V% a2 X , q+ x( |5 _$ G2 Y& @ N9 p- y% j) ?4 X$ U1 d 近年有实验证明，血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）能够诱导人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）分化为心肌样细胞. 而脂肪间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells，ADMSCs)［1］以其独特的优点在再生医学及组织工程领域有着更为广阔的应用前景. ADMSCs是否也能够被AngⅡ诱导向心肌细胞方向分化，AngⅡ的诱导分化作用与传统的化学诱导剂5氮杂胞苷（5azacytidine，5aza）有何不同？目前有关这方面的研究相对较少. 本实验通过使用AngⅡ作为促分化物质，观察其对ADMSCs向心肌细胞分化的影响，并与5aza比较，以期优化ADMSCs的体外诱导分化条件.( O" e: c! S3 @2 x' O
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统计学处理： 数据采用SPSS 10.0软件处理，组间比较采用Oneway ANOVA方差分析，P$ \& }; S6 C; V" {
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2结果* S; i/ O& \ |, F4 @! J# M
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2.1形态学改变倒置相差显微镜下观察，ADMSCs经AngⅡ或5aza诱导后7 d左右，形态均开始发生改变，逐渐变长、变大，呈短棒状，有分支，类似心肌细胞. 同时也观察到AngⅡ组细胞增殖迅速，有聚集生长的趋势，而5aza组见部分细胞皱缩、脱壁，甚至降解、死亡（图1）. 诱导后14 d透射电镜下观察，ADMSCs拉长呈不规则形，胞核呈长梭形，有沟槽，细胞器增多，其中AngⅡ组细胞的胞质丰富，有大量线粒体、内质网、溶酶体等细胞器，并可见肌丝样结构，细胞状态良好；而5aza组部分细胞的细胞器空化，胞质内可见较多空泡形成，这是细胞受到毒性作用的表现；对照组细胞较幼稚，胞体圆形，表面有较多伪足，核大、圆，核仁大、染色深，有分叶，细胞器较少，未见肌丝样结构（图2）.! X4 y: u1 o. v! X0 W
: B# z, z* p' r/ a+ U A： AngⅡ组； B： 5aza组. # f& F* `" E M$ S) L8 X 5 p; v0 h- e; G+ H6 z% P- y/ o/ V 图1诱导后28 d光镜下的形态特征100（略） . S: B1 f K1 ^+ q! {% X# U2 G. F; U4 Q! @
2.2免疫细胞化学染色诱导后28 d，免疫细胞化学染色显示AngⅡ组和5aza组均表达cTnⅠ（图3），对照组未见cTnⅠ表达. 统计学分析转化率，AngⅡ组为(30.73±3.49)%，5aza组为(31.27±3.52)%，二者之间差异无统计学意义（P>0.05）.9 ]$ O( m& F2 Z
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2.3细胞活性统计学分析A值，AngⅡ组为0.3075±0.04，5aza组为0.0825±0.01，两组与对照组（0.19±0.02）相比，差异均有统计学意义（P : @# J* s" D! A; A/ A' O; {* }6 p5 M) M6 h6 _0 X/ o
2.4细胞增殖周期及凋亡流式细胞术分析S期，AngⅡ组为42%，明显高于对照组（5.3%），5aza组为2.0%，低于对照组. 同时分析细胞凋亡，5aza组为32.0%，明显高于对照组（1.7%），AngⅡ组为12.6%. 可见AngⅡ具有促进ADMSCs增殖的作用，而5aza则对细胞具有一定的毒性作用，引起细胞凋亡，这与在光镜及电镜下观察的结果一致. ' c: A! D3 x1 L & W, a' @% W. |) `4 z% X4 _4 q A： 对照组8000； B： 诱导后第14 d6000； C： AngⅡ组15 000； D： 5aza组15 000. `( ~/ f$ I6 b* G; p 8 E' f: p1 N- w K, B' w 图2ADMSCs的超微结构（略） 0 F! ~. s* i4 J' G. n$ [' H 7 M& n& a% p7 x% r A： AngⅡ组； B： 5aza组. 6 Q% d1 b4 b* M: D, D$ {& ?- |% H) p7 P8 i3 w0 } Y% z. m; K3 D
图3免疫细胞化学染色显示cTnⅠ阳性表达200（略） 3 [& `, J' u! V. l& U" p0 U8 I + Q& x- j6 {* ?4 _% v$ W. r 3讨论 4 h* R* G* O. B7 A8 t. a# d& k; {2 h2 a4 d
4 S8 l3 |; u" `- }0 E 6 c& o+ \4 X; H. g f9 e3 K- V: ^ 以往的实验多采用化学诱导剂5aza. 5aza是胞嘧啶核苷的一个类似物，可引起DNA中某些胞嘧啶低甲基化，从而参与激活表型特异性基因，启动干细胞向心肌细胞分化［2］. 同时还观察到，作为化学诱导剂的5aza对细胞有一定的毒性作用［3］. 在本实验中，我们也观察到同样的结果，ADMSCs经5aza作用后，部分细胞皱缩、脱壁、胀大，甚至降解、死亡，电镜下见部分ADMSCs胞质内有大量空泡形成，细胞器空化. 所以，寻求某种安全、有效、经济、可行的诱导剂成为ADMSCs真正走向临床急需解决的问题.3 i# i& k% ]: q: v; B3 A0 x: N4 _
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; N1 K. V# p) D1 |6 L6 [. F* A 在这一方面，国内外学者做了大量工作. 国外Gaustad等［4］、国内李宾公等［5］用鼠心肌细胞提取物成功将人ADMSCs诱导分化为心肌样细胞，并且发现心肌细胞裂解液的这种诱导分化作用具有浓度依赖关系，推测心肌细胞中含有一些具有诱导分化作用的可溶性物质. 但是心肌细胞提取物成分复杂，应用于临床存在许多不确定因素. 6 Y. ^# A2 G% A' y % Y% h; j, a) A+ z$ Z6 g, M" @' C5 I# s
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近年国内苑媛等［6］用AngⅡ将人BMMSCs成功诱导为心肌样细胞，提示AngⅡ可能是心肌细胞提取物的有效成分或其中之一. 在本实验中，我们使用AngⅡ作为促分化物质，证实ADMSCs经AngⅡ作用后能够表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ），并具有肌细胞的超微结构，说明AngⅡ可以诱导ADMSCs分化为心肌样细胞，其诱导转化效能与5aza无差别. 同时还观察到AngⅡ作用于ADMSCs后，细胞增殖迅速、有聚集生长的趋势，流式细胞术也证实S期细胞较多，凋亡细胞较少，而5aza作用后恰恰相反. 说明AngⅡ对细胞无毒性，且可促进ADMSCs的增殖.( W" U! H" T. U3 Q, q
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8 S: [2 G s+ o$ l7 s3 f AngⅡ的诱导分化机制尚不十分清楚. 有研究显示，AngⅡ可以引起MAPK酪氨酸磷酸化而活化ERK［7］，能促进TGF β1基因，TGF β受体基因表达［8］，进而又激活包括MAPK, PKA, PKC等在内的多条信号转导通路［9］，导致多种细胞活化［10］. 推测AngⅡ的这种诱导分化机制可能与活化这类细胞信号转导通路有关. 在今后的实验中，我们将就诱导分化机制方面作进一步的研究. 总之，细胞因子AngⅡ，能够在促进ADMSCs增殖的同时诱导其向心肌细胞分化，是一种更具临床应用前景的生物活性诱导剂., @+ r p, k) D
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