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标题: 腺病毒载体介导SCL基因转染 Cajal间质细胞及其表达 [打印本页]
作者: 文献管理员    时间: 2009-3-3 12:36     标题: 腺病毒载体介导SCL基因转染 Cajal间质细胞及其表达

作者：张林  童卫东  刘宝华  李春穴　作者单位：400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所普通外科
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9 H3 l; q! X) _2 n  n" z9 G                    ~3 R" q$ R" {# ^
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                         0 P9 t1 t; h  f! V7 K% u7 k
            ( ]+ T) d8 a! R' a( [$ a
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                      1 y7 s$ n9 q" M0 R' A4 N& A2 P
        , q7 E$ Q" C& ~: W! ~, p1 p% O9 w
        & t! g. T/ c$ G
          J" _  C' W: O# q
          【摘要】  目的  构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体，并观察其对Cajal间质细胞的转染及其介导的SCL基因的表达。为下一步在体转染Cajal间质细胞，观察其对Cajal间质细胞表型逆转的影响奠定基础。方法  利用AdEasy系统、细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒AdGFP/SCL。通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对培养的Cajal间质细胞的转染效率。通过RTPCR法分析转染Cajal间质细胞后SCL mRNA的表达。结果  酶切鉴定及PCR结果证明成功构建了含有人SCL基因的重组腺病毒，病毒滴度为1.6×1011 pfu/ml；对Cajal间质细胞的转染率高达100%；RTPCR法检测转染Cajal间质细胞后SCL mRNA有表达。结论  成功构建的含人SCL基因的重组腺病毒对Cajal间质细胞有很强的转染能力，可介导SCL基因在Cajal间质细胞中表达。
+ S$ w+ k) E9 t7 a/ B          【关键词】腺病毒载体；  干细胞白血病基因；  同源重组；  转染；  Cajal间质细胞- u1 G6 o+ M, F7 q4 A- J
                  Adenovirus vector mediating SCL gene expression and transfecting Cajal interstitial cells and expression of adenovirus vectorZHANG Lin, TONG Weidong, LIU Baohua, LI Chunxue. Department of General Surgery, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
0 k0 H+ I: q% l; b" U, N8 {
2 v3 g3 K3 n7 d& QCorresponding author: LIU Baohua, Email: lbh57268@163.com
+ R. e) M/ [3 z8 L% e( O/ G, h; \0 B7 C0 A
【Abstract】ObjectiveTo construct recombinant adenovirus vector containing human stem cell leukemia (hSCL) gene to observe its ability in transfecting Cajal interstitial cells and mediating SCL gene expression, which may lay basis for further in vivo transfection of Cajal interstitial cells to observe the effect of the recombinant adenovirus vector on changes of monotype of Cajal interstitial cells. MethodsThe recombinant adenovirus AdGFP/SCL was rapidly constructed by using AdEasy system based on the homologous recombination in bacteria. Then, Cajal interstitial cells cultured in vitro were infected with 1.6109 pfu of recombinant adenovirus. The distribution and efficiency of recombinant adenovirus mediated hSCL was observed by expression of green fluorescence protein (GFP) under the fluorescent microscope. The expression of hSCL mRNA transfected with Cajal interstitial cells was measured by RTPCR method. ResultsRestriction endonuclease and PCR analyses confirmed that the hSCL gene was successfully inserted into the adenovirus vector, with titer of the recombinant adenovirus for 1.61011 pfu/ml. The adenovirus had a high transfection efficiency up to 100%. RTPCR analysis showed expression of hSCL mRNA in Cajal interstitial cells transfected by hSCL. ConclusionsThe recombinant adenovirus containing human hSCL gene is successfully constructed by homogenous recombination in bacteria and it has a high transfection efficiency and can mediate expression of Cajal interstitial cells./ \4 \/ i. d5 [

' H! n' U8 {" Z; A# ]9 y【Key words】Adenovirus vector;Stem cell leukemia gene;Homogenous recombination;Transfection;: R0 q8 }$ t! a( z0 Z5 Q+ k
& b4 a6 f8 H) C' P
Cajal interstitial cells
, W5 G1 w+ w( i, T! k% ^) J) A8 {! S# s: o, c/ R
干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因最早发现于T淋巴细胞急性白血病细胞内，编码一种螺旋环螺旋类转录因子。研究证明SCL是ckit上游的重要调控基因，通过作用于ckit基因启动子调节ckit表达，具有强烈的促ckit表达作用［1］。近期研究表明， 一些外源性因素导致ckit表达下调，引发SCF/ckit通路异常，驱使Cajal间质细胞发生平滑肌细胞样表型转化(而非凋亡)，最终导致胃肠动力障碍，可能是慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)等众多胃肠动力紊乱性疾病Cajal间质细胞减少的共同机制［2］。为此，本实验拟构建表达人SCL基因的重组腺病毒载体，观察其对Cajal间质细胞的转染及其介导的SCL基因的表达能力。为下一步在体转染Cajal间质细胞,观察其对Cajal间质细胞表型逆转的影响奠定基础。" W  G4 p$ `- T+ [

" v2 b& ^$ K7 |( C. w$ M　　1材料与方法& ~8 q+ ^- _0 z) R* ^; p
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1.1质粒、菌株、细胞株、实验动物和主要试剂" R1 n& n" ]) q$ B0 k
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含有人SCL cDNA质粒pIRES2EGFP/SCL由本科李春穴博士惠赠，BJ5183菌株、pAdTrackCMV、pAdEasy1由Johns Hopkins大学He TC教授惠赠，pcDNA3.1( )、AdGFP/Wnt由重庆医科大学季业伟博士惠赠，DH5α、Hela以及HEK293细胞株由大坪医院野战外科研究所7室长期保存。Balb/c小鼠，出生后15～20 d内，雌雄不限，清洁级，由大坪医院野战外科研究所动物试验中心提供。各种限制性内切酶、T4DNA连接酶分别购自MBI、Promega公司，脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000购自Roche公司，小量质粒DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Omega公司，RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司，PCR引物由上海生物工程有限公司合成。( \8 {; o- o* I" z

2 w6 f  h1 W2 @+ }. \1.2重组腺病毒的快速构建" H# O- v; j2 K: m) ~! _- d

: d9 O" Y. O9 w! i5 f参照文献［3］进行：(1)pcDNA3.1( )/SCL的构建：用EcoRⅠ单酶切法将pIRES2EGFP/SCL的SCL片段克隆到pcDNA3.1( )的EcoRⅠ位点。(2)pAdTrackCMV/SCL的构建：用HindⅢ和XhoⅠ双酶切法将SCL片段定向克隆到pAdTrackCMV。(3)重组腺病毒质粒载体pAdeasy1/SCL的构建及鉴定：电穿孔法。抗性筛选、酶切鉴定转化阳性菌落。
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1.3重组腺病毒的包装、鉴定、扩增和纯化
+ k: `* R- T! [1 J
% i* i7 S! [/ T参照文献［3］进行。其中PCR鉴定引物如下：上游为：5′TCCGGCGGAGTGGAGATCCTATTC3′，下游为：5′TGGCTGATCCTGGTGGCCCAGAC3′。扩增条件是94 ℃变性40 s→60 ℃退火50 s→72 ℃延伸60 s(35个循环)→72 ℃延伸10 min。1 n8 t  u/ {0 a: Y3 `+ Q: [

6 J' I" i3 s) A1.4病毒滴度测定以及生物安全性的观察5 W) P0 x' E+ }$ ^2 ^3 k

, u+ ]3 E( m6 o; D& t* x, ~( P8 X病毒滴度参照文献［3］进行。在六孔板上按照2106浓度接种Hela细胞，待长至融合度约70%时，重组腺病毒感染Hela细胞(MOI=50)，经反复传代3次以上观察细胞形态变化以观察重组腺病毒的生物安全性。
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1.5Cajal间质细胞的体外培养、实验分组及处理1 }) H; S$ i2 C" {: h

# J/ T$ V& k, J( h4 s5 [5 n参照文献［4］方法培养Cajal间质细胞。实验分组及处理：正常对照组、阳性对照组和腺病毒处理组。其中腺病毒处理组给予1.6109 pfu的重组腺病毒AdGFP/SCL。
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1.6重组腺病毒AdGFP/SCL对培养的Cajal间质细胞的转染效率
; o; R9 f0 A. x( V9 x  @, I( ~: E- C) y1 E7 N/ {: P5 Q8 ?
于转染后48 h在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数。在荧光显微镜下随机挑取5个高倍视野，分别计算绿色荧光阳性和阴性的细胞的平均数，阳性细胞百分数代表细胞的转染效率。
) j% \& x- T) P3 Q2 z& N+ @; B. S- K
' \3 Z  V3 }. T& v3 d1.7重组腺病毒AdGFP/SCL介导的SCL基因在Cajal间质细胞中的表达
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5 G* _" G" J# {分别于转染后2、7、15 d提取Cajal间质细胞总RNA，RTPCR法分析SCL mRNA表达。上、下游引物及反应参数同前。3 n# W( ]) w$ i/ @  r) z2 B: g
/ E4 z1 R/ _3 L: {; m( ^5 ]
2结果3 M# Q% k4 D" c8 O$ v, W$ [

  R& i! e0 E! K0 `2.1构建的中间质粒及重组腺病毒鉴定4 g$ `7 e. q/ k0 J' m

# r8 X1 g9 `- s. U& p酶切鉴定：对pcDNA3.1( )/SCL质粒进行EcoR Ⅰ酶切，可得到约1 kb小片段和约5 kb大片段，其中约1 kb小片段与插入的目的片段大小相一致(图1)。对pAdTrackCMV/SCL质粒进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切，前者得到约1 kb小片段和约9 kb大片段，其中约1 kb小片段与插入的目的片段大小相一致(图1)。两质粒的插入目的片断经测序鉴定：与GenBank报道完全一致。对pAdeasy1/SCL质粒进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切，可得到约1 kb小片段和约35 kb大片段，其中约1 kb小片段与插入的目的片段大小相一致(图1)。用PacⅠ酶切，pAdeasy1/SCL质粒可出现一个约30 kb的大片段和一个约4.5 kb的特征性小带而得以鉴定。
4 B2 b" \5 `( ?# o
& U2 I1 w$ i9 N7 a: r2.2重组腺病毒AdGFP/SCL的产生、鉴定及滴度测定
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& H4 @5 q% Y5 a+ RpAdeasy1/SCL经脂质体转染293细胞后24 h出现绿色荧光蛋白表达，荧光表达随时间增强。约5～7 d左右，293细胞开始出现细胞病变效应，表现为细胞肿胀、变圆、蚀斑出现(图2)。阳性空斑抽提物经PCR扩增检测，可特异性扩增出约1 kb的SCL cDNA片段。而未转染的细胞基因组未扩增出相应条带(图3)。本实验单孔细胞计数平均为8.0108，根据前述滴度测定公式，计算病毒滴度为1.61011 pfu/ml。
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* D, y( N4 G& Z) h2.3重组腺病毒AdGFP/SCL生物安全性的观察' v( A) o$ X7 ]0 N; n! J
  G  O8 [% D1 m
重组腺病毒感染Hela细胞(MOI=50)，经反复传代3次以上细胞生长未受影响，未见细胞病变效应，排除了有复制能力的腺病毒污染的可能性(图4)。# f2 _* ^: B$ P( K

- q$ y7 T2 Y7 S/ b  h3 a# L3 `2.4重组腺病毒对Cajal间质细胞的转染* E' V' g" ~# S

3 _( C) w. ]9 K! k; Y用不同MOI的重组腺病毒感染Cajal间质细胞，当MOI为50时，超过90%的细胞出现绿色荧光蛋白表达。当MOI为100时，100%的细胞出现绿色荧光蛋白表达。表明所构建的重组腺病毒生物活性高，可以有效地转导目的基因表达(图5)。- o7 y, J! P% g. z) s8 I6 a
/ ^! h! \! y8 [& f( e5 `8 T, G
2.5重组腺病毒AdGFP/SCL介导的SCL基因在Cajal间质细胞中的表达。4 c6 c! d6 @2 F1 Y) l3 c- q

8 J. Z4 h2 I. a4 j3讨论
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  Z9 x+ o* f, ^! m& B7 PCajal间质细胞是胃肠道的起搏细胞，具有产生、传播慢波的功能，参与调控肠神经信号传递［5］。业已证明慢传输性便秘、慢性假性肠梗阻等众多胃肠动力紊乱性疾病都存在Cajal间质细胞数目减少［6］。新近的研究提示Cajal间质细胞发生平滑肌细胞样表型转化(而非凋亡)可能是众多胃肠动力紊乱性疾病Cajal间质细胞减少的共同机制［2］。. Y! k! B* B0 v# N* S: a$ D& c

+ \1 E3 i! K# H% ]. V$ B研究证明Cajal间质细胞细胞膜特异性表达ckit。ckit作为受体酪氨酸激酶家族的重要成员，与其配体干细胞因子(stem cell factor,SCF)结合后所启动的信号通路，不仅对造血干细胞、成黑色素细胞等具有重要的调控作用，对Cajal间质细胞发育、分化及胃肠道节律性活动的稳定也至关重要［7］。腹腔注射ckit封闭性单抗ACK2可使小鼠肠道Cajal间质细胞表型转化呈平滑肌细胞样表型，肠道慢波消失。我们前期的研究表明ckit表达下调可能是引起上述病变的主要病理机制。
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" e' F: {/ A" {1 q2 k5 C; fSCL基因位于1号染色体短臂(1P32)，最早发现于T淋巴细胞急性白血病细胞内，编码一种螺旋环螺旋类转录因子。SCL主要表达于造血系统、上皮及部分中枢神经系统，对SCF依赖型细胞的生存具有重要的调控作用。研究证明SCL是ckit上游的重要调控基因，通过作用于ckit基因启动子调节ckit表达来发挥其“生存基因”的功能，具有强烈的促ckit表达作用［1］。如果采用基因工程技术，将SCL基因导入Cajal间质细胞，能否增加ckit的表达，从而逆转Cajal间质细胞表型转化呢？
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/ D" I: V' N2 R- e7 Z本实验所使用的构建重组腺病毒的AdEasyTM系统是代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统中，只需两步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组在大肠杆菌内进行。相对于传统的同源重组法而言，这两点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效同源重组特性而使重组载体的筛选变得更为简单。本实验中，由于携带目的基因SCL的穿梭质粒pAdTrackCMV多克隆位点两侧及腺病毒骨架质粒pAdEasy1基因组两侧均存在相同的同源序列，在大肠埃希氏菌BJ5183中很快实现同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdeasy1/SCL。经脂质体转染HEK293细胞，最终包装产生重组腺病毒。超速离心纯化后病毒滴度测定在1010～1011 pfu/ml之间。整个实验过程前后耗时约2个月，证实该法确实简便、可靠、高效,值得进一步推广应用。0 A$ i" B2 V5 i  ?6 A+ W% U' v) q
. _  T* c4 ?1 t" D
我们构建了含人SCL基因的腺病毒载体，经酶切鉴定以及PCR结果证实含人SCL重组腺病毒构建成功。病毒滴度达1.61011 pfu/ml，能高效、安全地转染体外培养的Cajal间质细胞，并且能介导的SCL基因在Cajal间质细胞中的表达。表明此重组腺病毒能有效介导人SCL基因转染Cajal间质细胞，为下一步Cajal间质细胞表型逆转的基因治疗研究奠定了基础。  u+ z2 T# q* ]4 K
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8 [* n( D: e& w. S3 W9 r2 \          【参考文献】9 U: Q( A) J$ p( W. {
［1］  Sánchez M J, Bockamp E O, Miller J, et al. Selective rescue of early haematopoietic progenitors in Scl(/) mice by expressing Sclunder the control of a stem cell enhancer. Development,2001,128(23):4815-4827.
0 z& l4 u2 o9 U0 T
* T( D- ~  C3 X0 }1 i* O  O6 x% x8 w0 t/ Z# f! u: N

. ~. F+ u3 H( U& I8 z% S+ i    ［2］  Lyford G L, He C L, Soffer E, et al. Pancolonic decrease in interstitial cells of Cajal in patients with slow transit constipation. Gut,2002,51(4):496-501.8 \4 S" @# \( Y  W

0 m  g1 P+ }) i6 }. E
  [$ [& z' X0 n! O, d4 t- T# C
) q4 O; P: |- `    ［3］  赵峰，周清华，覃杨.突变kras基因重组腺病毒的构建.中国肺癌杂志，2002，5(1)：14-17.
  ?! I! V  i: S
! Y3 X: Q/ ~- m, x, s' S9 f0 _  y% K- N" n/ q" Z
9 d- N& L9 F- c' E
    ［4］  李春穴, 童卫东, 刘宝华，等.Cajal间质细胞的分离、培养方法探讨.消化外科,2004，3(4)：267-269.. [$ J; K* E, x- c

  q* h! U3 Z1 ~; A9 {0 `
: K* m% u: G. X6 ?  q  }* N! S- |6 u7 ^9 F. X& V
    ［5］  Rich A, Hanani M, Ermilov L G, Malysz J, et al. Physiological study of interstitial cells of Cajal identified by vital staining. Neurogastroenterol Motil,2002,14(2):189-196.
6 n. c. L( _: h( i9 @* W4 |: f6 K# h8 U+ {# {

9 j/ w3 ^9 O0 x' I9 Z2 A
3 i# V2 {9 H# I3 c    ［6］  Sanders K M, Ordog T, Ward S M, et al. Physiology and pathophysiology of the interstitial cells of Cajal: from bench to bedside IV. Genetic and animal models of GI motility disorders caused by loss of interstitial cells of Cajal. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2002,282(5):G747-756.
. U. x7 f2 Q) @+ J! y/ T6 s, {' i. x) t8 }: ]8 A* F. _: W' u

0 U4 @# F' |) {! |$ F6 T( v; k
% w1 V  W0 ?4 @" B    ［7］  BlumerJensen P, Hunter T. Oncogenic kinase signaling. Nature,2001,411(6835):355-365.
作者: 科研人    时间: 2015-7-15 18:55

先顶后看  
作者: 龙水生    时间: 2015-7-27 15:10

今天没事来逛逛  
作者: 龙水生    时间: 2015-7-29 18:10

我在顶贴~！~  
作者: 橙味绿茶    时间: 2015-8-11 21:00

应该加分  
作者: awen    时间: 2015-9-7 17:51

祝干细胞之家 越办越好~~~~~~~~~`  
作者: 榴榴莲    时间: 2015-12-18 14:11

正好你开咯这样的帖  
作者: tuanzi    时间: 2015-12-31 17:27

帮你顶，人还是厚道点好  
作者: 陈晴    时间: 2016-1-4 08:43

帮你项项吧  
作者: biobio    时间: 2016-2-3 14:10

希望可以用些时间了~````  
作者: yukun    时间: 2016-2-5 20:27

希望大家都有好运  
作者: 123456zsz    时间: 2016-3-14 09:18

不知道说些什么  
作者: foxok    时间: 2016-3-26 20:57

顶你一下，好贴要顶！  
作者: 三星    时间: 2016-3-29 15:35

应该加分  
作者: immail    时间: 2016-4-29 18:42

谁都不容易啊 ~~  
作者: ladybird    时间: 2016-5-7 14:17

不错!  
作者: s06806    时间: 2016-5-27 15:54

干细胞从业人员  
作者: tempo    时间: 2016-6-20 11:43

好人一个  
作者: 20130827    时间: 2016-7-15 12:27

呵呵 高高实在是高~~~~~  
作者: alwaysniu    时间: 2016-7-15 13:27

一定要回贴，因为我是文明人哦  
作者: lalala    时间: 2016-7-18 19:51

知道了 不错~~~  
作者: ringsing    时间: 2016-8-7 19:54

不错不错.,..我喜欢  
作者: syt7000    时间: 2016-8-8 09:27

一个有信念者所开发出的力量，大于99个只有兴趣者。  
作者: 一个平凡人    时间: 2016-8-23 23:04

胚胎干细胞
作者: 考拉    时间: 2016-9-3 17:09

自己知道了  
作者: happyboy    时间: 2016-10-20 13:18

严重支持！
作者: awen    时间: 2016-11-4 21:18

dc-cik nk  
作者: changfeng    时间: 2016-11-6 15:43

好帖子，要顶！
作者: 桦子    时间: 2016-11-10 17:41

问渠哪得清如许，为有源头活水来。  
作者: 水木清华    时间: 2016-12-23 10:54

应该加分  
作者: lab2010    时间: 2017-1-4 03:48

偶啥时才能熬出头啊.  
作者: aakkaa    时间: 2017-1-4 18:40

昨天没来看了 ～～  
作者: renee    时间: 2017-1-15 21:08

初来乍到，请多多关照。。。嘿嘿，回个贴表明我来过。  
作者: 榴榴莲    时间: 2017-2-4 07:33

人之所以能，是相信能。  
作者: 杏花    时间: 2017-2-20 12:35

哈哈 我支持你
作者: ikiss    时间: 2017-3-6 06:42

你加油吧  
作者: 依旧随遇而安    时间: 2017-3-15 12:27

干细胞抗衰老  
作者: 983abc    时间: 2017-3-17 15:17

楼主，支持！  
作者: whyboy    时间: 2017-3-24 01:12

太棒了！  
作者: qibaobao    时间: 2017-4-4 19:35

越办越好~~~~~~~~~`  
作者: 坛中酒    时间: 2017-4-22 08:27

谢谢分享  
作者: 20130827    时间: 2017-5-13 22:43

继续查找干细胞研究资料
作者: 安生    时间: 2017-5-18 14:34

说的不错  
作者: pcr    时间: 2017-5-22 14:27

昨晚多几分钟的准备，今天少几小时的麻烦。  
作者: 咖啡功夫猫    时间: 2017-5-31 11:27

不错，支持下  
作者: 温暖暖    时间: 2017-5-31 12:43

感谢党和人民的关爱~~~  
作者: 追风    时间: 2017-6-4 06:18

小生对楼主之仰慕如滔滔江水连绵不绝,海枯石烂,天崩地裂,永不变心.  
作者: immail    时间: 2017-6-7 04:06

看完了这么强的文章，我想说点什么，但是又不知道说什么好，想来想去只想  
作者: 草长莺飞    时间: 2017-6-9 06:59

(*^__^*) 嘻嘻……  
作者: 张佳    时间: 2017-6-13 03:06

我来了~~~~~~~~~ 闪人~~~~~~~~~~~~~~~~  
作者: alwaysniu    时间: 2017-6-14 20:24

干细胞存储  
作者: www1202000    时间: 2017-7-17 05:02

进行溜达一下  
作者: xm19    时间: 2017-7-28 01:31

支持一下吧  
作者: 坛中酒    时间: 2017-7-29 10:10

真的有么  
作者: 知足常乐    时间: 2017-8-2 06:23

抢座位来了  
作者: feixue66    时间: 2017-8-22 15:01

不错的东西  持续关注  
作者: 温暖暖    时间: 2017-8-23 13:28

心脏干细胞
作者: 杏花    时间: 2017-9-13 01:44

干细胞研究人员的天堂
作者: 剑啸寒    时间: 2017-9-20 03:07

勤奋真能造就财富吗？  
作者: 20130827    时间: 2017-10-13 19:12

好人一个  
作者: 水木清华    时间: 2017-10-19 05:32

写得好啊  
作者: SCISCI    时间: 2017-10-19 21:07

这贴？不回都不行啊  
作者: 蝶澈    时间: 2017-10-27 19:17

干细胞抗衰老  
作者: bioprotein    时间: 2017-10-31 00:33

支持你加分  
作者: dr_ji    时间: 2017-11-5 00:08

不看白不看，看也不白看  
作者: 锦锦乐道    时间: 2017-11-13 10:27

顶也～  
作者: 小丑的哭泣    时间: 2017-12-26 06:50

楼上的话等于没说~~~  
作者: 三星    时间: 2018-1-6 21:02

真好。。。。。。。。。  
作者: changfeng    时间: 2018-2-11 10:12

应该加分  
作者: sshang    时间: 2018-2-14 13:26

干细胞之家
作者: immail    时间: 2018-2-16 10:52

都是那么过来的  
作者: dataeook    时间: 2018-2-16 19:54

越办越好~~~~~~~~~`  
作者: DAIMAND    时间: 2018-2-24 00:47

继续查找干细胞研究资料
作者: chongchong    时间: 2018-3-1 05:26

回帖是种美德.  
作者: 蝶澈    时间: 2018-3-4 19:18

也许似乎大概是，然而未必不见得。  
作者: na602    时间: 2018-3-28 19:00

支持一下吧  
作者: youngcell    时间: 2018-3-30 23:15

天啊. 很好的资源
作者: marysyq    时间: 2018-4-11 01:17

一楼的位置好啊..  
作者: youngcell    时间: 2018-4-13 13:10

嘿嘿  
作者: whyboy    时间: 2018-4-19 05:59

我想要`~  
作者: aliyun    时间: 2018-4-21 09:27

应该加分  
作者: 锦锦乐道    时间: 2018-4-21 22:42

说的不错  
作者: 天蓝色    时间: 2018-4-26 16:10

看完了这么强的文章，我想说点什么，但是又不知道说什么好，想来想去只想  
作者: 天蓝色    时间: 2018-5-19 15:10

祝干细胞之家 越办越好~~~~~~~~~`  
作者: immail    时间: 2018-5-22 22:35

一定要回贴，因为我是文明人哦  
作者: 求索迷茫    时间: 2018-5-23 16:27

任何的限制，都是从自己的内心开始的。  
作者: ikiss    时间: 2018-5-27 05:56

我等你哟!  
作者: sky蓝    时间: 2018-5-31 04:17

干细胞研究还要面向临床
作者: apple0    时间: 2018-6-28 04:51

照你这么说真的有道理哦 呵呵 不进沙子馁~~~  
作者: pcr    时间: 2018-7-8 18:52

说的真有道理啊！
作者: 心仪    时间: 2018-7-10 11:36

干细胞美容
作者: 初夏洒脱    时间: 2018-7-10 20:10

不要等到人人都说你丑时才发现自己真的丑。  
作者: dd赤焰    时间: 2018-7-13 00:27

干细胞研究还要面向临床
作者: changfeng    时间: 2018-7-16 08:10

不错，看看。  
作者: leeking    时间: 2018-8-4 14:01

好人一生平安  
作者: 橙味绿茶    时间: 2018-8-31 05:40

初来乍到，请多多关照。。。  
作者: 张佳    时间: 2018-10-15 16:00

天啊. 很好的资源
作者: 与你同行    时间: 2018-11-15 20:33

转基因动物
作者: immail    时间: 2018-11-23 17:38

又看了一次  
作者: 陈晴    时间: 2018-11-24 23:34

不错不错.,..我喜欢  



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