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标题: 求助胚胎干细胞培养方法 [打印本页]

作者: 300000 时间: 2010-12-15 10:00 标题: 求助胚胎干细胞培养方法

先谢谢各位战友了，谁能帮我介绍一些培养方法，大概流程，多多益善、再次感谢

作者: 细胞海洋 时间: 2010-12-15 11:13

本板块有很多先自己搜索一下

作者: 随风的天使 时间: 2010-12-15 12:22

说的详细点，每种胚胎干细胞的培养方法都不同，的依情况而定。

作者: cailand 时间: 2010-12-15 15:15

人的还是鼠的，或是其他物种的？

作者: 300000 时间: 2010-12-15 16:09

人的ES和胎儿成体干细胞，谢谢，请指教。

作者: 300000 时间: 2010-12-15 16:10

回复 cailand 的帖子
3 Q" m% y. K o% w" ]7 V, k& J# A
人的ES和胎儿成体干细胞，谢谢，请指教

作者: cony 时间: 2010-12-15 20:25

论坛已经有很多了，自己先找找看，

作者: 300000 时间: 2010-12-16 11:06

谢谢大家的建议，都找过了，没有很完整的，而且都是一些冻存方法、请各位继续指点。

作者: syl82 时间: 2011-2-15 20:10

本帖最后由细胞海洋于 2011-2-15 23:31 编辑 & P/ s- {1 M- Y0 I! w. l( n
. T" x; f* Y+ ^/ b' |6 J9 ]

培养条件
环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。 % X+ L# E; k+ {# ]
实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 7 _3 M1 B& F! Z8 @- L
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。 , B! y! l, L; ~! [  N
试剂的配制： # B, B3 D0 N1 d8 p' B
DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子 " l  X3 g' k! ]/ Z. l8 D$ z
D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红   \, i3 h' `. @7 F
0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶 8 z# d: D9 _, `0 S* o5 m
ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO ( f2 d' d- _9 _) X& H9 E
MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制
培养步骤
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
. Y2 Y  A4 {  s4 ^, _
小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 2 ^0 j$ H0 I) s; r9 m* {" o- t
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。

在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 0 ]* F$ i5 A; }  O) a
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 & i5 U/ |, r; T, j. [
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 1 w$ {2 }; u" W" o0 j" O  D! n! {
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 4 |$ B$ X8 T' U* W6 [2 E% X1 Z/ {6 {
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 # ^2 a0 T$ y' v- G7 `" B4 [
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 6 t; c6 ~8 ^1 k' A
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。 : _; P6 P1 I6 @
小鼠胚胎干细胞的传代 ( ]) `2 n/ {; I6 E( k& W
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 1 l5 G% v2 ?7 s: Z" z0 s  R8 O
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 * ]" k2 i& D& F" y
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。 6 M' T5 n: Q2 @
小鼠胚胎干细胞的冻存 * [3 y: P! X& A8 M; a
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 7 s/ g1 R0 M% S
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 ! I3 k% E9 O) r, E
注意事项
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 2 q. K6 A; `* |; X; f; ~+ E- v
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。 0 o  E+ U% F3 s/ w
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

作者: 300000 时间: 2011-2-19 08:29

很感谢。

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