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标题: 人胚胎干细胞培养 [打印本页]

作者: hcluo 时间: 2010-12-15 22:23 标题: 人胚胎干细胞培养

人胚胎干细胞培养，共享资料！

作者: syl82 时间: 2011-2-15 20:11

本帖最后由细胞海洋于 2011-2-15 23:31 编辑
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培养条件
环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。 & O3 s5 j% u! j
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。 - v6 w8 C. ~, c: t$ z+ ?  P
实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。 ' A" I* l$ u" }; y& m
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
试剂的配制： & o3 @+ a" g$ c" [& l
DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3 9 i: z9 U% X4 n  [' L6 U
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素 0 H0 ~! S! z9 S* p$ a& A
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子 % j. a# L3 s$ b; P* _  \! b; a
D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红 ( f# o6 S+ M; Z( f% |6 B0 T
0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶 ! X% e; q' W+ ~. L' N3 u* b
ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO / f. J7 h& M5 i" b+ T
MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO # G4 M3 z& K' i! k3 t% o
丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制
培养步骤 $ j5 Z( G( \$ j
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。

小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 6 b: K: e8 R, H1 t+ v! g8 x
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。 7 I) P4 m+ o' Z
3 }5 L8 a* Q  X3 Q/ v/ W
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。 : J  ?( X; d9 ?
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。   R% g4 r4 W( Q4 p  n4 M$ e& e
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备   z9 Y6 n  W: L* G+ h2 t
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 : ?/ n* e: f3 P/ R; N
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可） 1 {. r1 ^3 Y8 V0 O1 A8 a
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 & M( _! l/ Q5 m/ H
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。 - B0 u% U0 g  q. p8 h
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
小鼠胚胎干细胞的传代 + D. L' e3 ?, t# ^. N
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 # {/ n' K$ M& h& T
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 : T9 j$ c  D& [: h( k0 ]
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
小鼠胚胎干细胞的冻存
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 1 S5 W7 L/ g) p. Y- O
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 4 a6 m" F& q# v+ A+ G0 A, _
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 . x' a, S0 {4 O0 U% t, M' j) K
注意事项 : ^: }* U4 m6 G' Z0 [
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

作者: hcluo 时间: 2011-2-19 21:05

给的十分详细啊！

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