干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站
标题:
人胚胎干细胞培养
[打印本页]
作者:
hcluo
时间:
2010-12-15 22:23
标题:
人胚胎干细胞培养
人胚胎干细胞培养，共享资料！
作者:
syl82
时间:
2011-2-15 20:11
本帖最后由 细胞海洋 于 2011-2-15 23:31 编辑
7 ~, F- m" C) C( ?4 {/ f
$ f" l: v) u N. X
培养条件
, O( }2 ]. X' B0 F" i
环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行。要求配有空气净化系统，能够对整个房间进行杀菌的紫外灯。
$ l; ~9 e- V8 a% u$ U1 f, i" }" R8 h/ l
设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等。
% l( D3 B0 B8 [4 z/ J' }
实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml或50ml离心管、脱脂棉花、封口膜等。
* Z) w2 K) ~$ N1 T
试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂。
. @, f, k1 ~% J* B9 @+ a
试剂的配制：
+ x& d; ]8 _. X9 T
DMEM培养基: 去离子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3
& \% `5 D8 N6 ^
MEF培养基：DMEM培养基中含10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素
8 e9 ^! {% l* w! ]# M
ES培养基: ES培养基：DMEM培养基中含15% FBS，1×106 U青霉素，1×106 g链霉素，1mM丙酮酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子
* M# v$ h' Q& p7 c( c
D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001%酚红
; ~( ~" P' n' h8 v
0.1%明胶: D-Hank’s溶液中含0.1%的明胶
8 v v. l& \0 f) K( ~
ES细胞冻存液：90% ES培养基，10% DMSO
0 {% o! U8 p3 Y+ W4 D; v2 p
MEF细胞冻存液：90% MEF培养基，10% DMSO
6 u, O1 @: \9 W; ]$ y! x
Feeder细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO
9 l4 U& s8 }2 q; J' F3 W" Y
丝裂霉素C: 根据产品说明书来配制
- ?+ Z& n( L' k9 G
培养步骤
# C3 B2 T0 y" a3 N- A4 y: N/ k
常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。
! `; G X0 @1 Z8 E
( T3 \% t; |! _- M6 e
小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏
, `: G* J2 U- r, \ t r
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。
; A' n3 {" S% {9 I& q2 V
; `( J# |; |# u$ T
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
: F, U4 j) M& `1 P# a L: P: K
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
: Y% U5 L4 k" K
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
+ A f' E! Z- p& ]2 {4 P
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。
" ^! S: Y5 H( _+ @% H9 X
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备
/ M2 e4 w& i7 b6 X
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。
+ A1 m$ ~& s# b8 b
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。
( L. G3 ]4 Y& g1 S
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
3 R; e5 @$ Z9 q6 C; b/ e8 D) q' B
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）
) P* C# S- _* m2 I+ h
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。
7 L; e& y+ a3 w5 [$ A, ~9 W0 r: q! _
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
$ u; G' G4 n% f/ ?7 m1 Z6 |
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。
: }# F7 h/ l4 \) C1 ]) D( @
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。
2 ?! f1 j, X, o x0 |# G! B
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
# U6 ?" n9 _% p: X+ _" w
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
' R9 I0 ^$ }7 N) }
小鼠胚胎干细胞的传代
, k2 ? \% H" ^* t% o
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
8 X9 V+ T+ w, L& ^1 x; M
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
6 M1 e) y0 |6 E% B# E* b- |5 b( R( ~
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
# Y) J( `5 @% y% A# p
小鼠胚胎干细胞的冻存
+ X" W1 M9 t% ^( q- w3 d' F
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。
3 X' ~9 C1 U0 ~
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
1 D+ W7 u8 A& X c0 ~( ~
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。
; w6 o8 G; x/ n# W
注意事项
) ?% [9 L7 N2 q1 {5 u
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。
1 S0 p" t2 v4 i5 e0 F" L
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格
0 l1 a9 s# }& N0 A- i# K: {$ v+ {
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
( j- x+ p/ b! w) Y) y) d
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。
作者:
hcluo
时间:
2011-2-19 21:05
给的十分详细啊！
欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)
Powered by Discuz! X1.5