$ x1 |; A" i N; E- S5 }, @ " A% |1 b" {- U6 L; o ; d# \: l# @! p1 r- _8 H! ~ ) Q+ {$ |+ t( Q6 b5 D: B. U% a 3 [! x3 H1 }+ q. J4 H
* ^8 K( R! S6 Y6 U2 F* z 8 u! A& b9 Q0 L ( d% ` X' A. Y( n/ i) a* v1 m$ w
) e% p) C) y- U1 U, g, r # h- C$ r1 i, ?! }( V ! I, Q4 f+ d5 L9 p/ r
: L, l% q; S/ H% \! I" D , T; w6 H+ ]5 e3 g8 J* R
【摘要】 目的: 研究BrdU, CFSE和GFP作为大鼠间充质干细胞标记物的可行性. 方法: 分别用上述三种标记物标记大鼠间充质干细胞，检测即时、15和30 d的标记率，通过检测细胞周期、凋亡率和描绘生长曲线，来明确标记物对体外培养大鼠间充质干细胞生长特性的影响；通过流式细胞仪检测标记物对细胞表面标志（CD29, CD34, CD44, CD45）表达的影响. 结果: BrdU, CFSE, GFP的即时标记率为77.0%, 99.4%, 89.7%，1 mo后分别下降至51.9%, 77.5%, 82.9%. 三者对体外培养的大鼠间充质干细胞的生长特性和表面标志的表达均无明显影响. 结论: GFP, BrdU和CFSE均可以作为大鼠间充质干细胞的标记物. 0 \( @5 Q# n: o; D$ p
【关键词】绿色荧光蛋白；溴脱氧尿嘧啶核苷；荧光染料CFSE；间充质干细胞 * O$ X3 b# }* }; `5 T 基金项目：广东省科技计划项目（2006B35901003） 7 H8 P2 J- v, }0 N D- Y, E/ U6 U7 n( C% `6 y' w4 r; ?3 O1 |& f1 [
Comparative investigation of BrdU, CFSE and GFP as markers of rat MSCs# _! A! U* Y! c
, v4 n' E: F. h1 Z' p/ `) { FU XiaFei, HE YuanLi, YANG Fang, PENG DongXian, LIU MuBiao/ n6 J3 o& B" S8 U4 y4 n
S1 N* {; o& q5 E# g& A
Department of Obstetrics and Gynecology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510280, China * B( m! [# C$ o 1 f! o* S, M( F: q5 v3 ^+ I/ ^ 【Abstract】 AIM: Toinvestigate the feasibility of labeling of BrdU, CFSE and GFP as labels of rat mesenchymal stem cells (MSCs) and to investigate the influence of the 3 markers on the growth characteristics and expressions of surface markers of rat MSCs. METHODS: Wistar rats bone marrow derived MSCs were isolated and purified in vitro by Percoll density gradient centrifugation combined with adherent method and were labeled with BrdU, CFSE and GFP, respectively. The immediate, 15day and 30day labeling efficiency of the 3 markers was quantified. The labeling efficiency of BrdU was detected with immunocytochemical method, and that of CFSE and GFP was detected via flow cytometry (FCM). The labeled MSCs were observed under microscope. Cell cycle and apoptosis rate of labeled MSCs were revealed and the growth curves were delineated, so as to identify whether or not the markers casted an influence on the cell growth characteristics in vitro. Furthermore, the surface markers (CD29, CD34, CD44, CD45)of the labeled MSCs were detected through flow cytometry and were compared with those of nonlabeled MSCs. RESULTS: The immediate labeling efficiency of BrdU, CFSE, and GFP was 77.0%, 99.4%,89.7% respectively, and the efficiency decreased to 51.9%, 77.5%, and 82.9% respectively after 30 d. There was no statistical difference in cell cycle and apoptosis ratio between labeled MSCs and nonlabeled MSCs. The growth curves of labeled MSCs were similar to that of nonlabeled MSCs. The 3 markers didnt influence the expressions of surface markers (CD29, CD34, CD44, CD45) of rat MSCs. CONCLUSION: The 3 markers have no effects on the growth characteristics and expressions of surface markers of rat MSCs cultured in vitro. BrdU, CFSE and GFP can serve as labeling markers of rat MSCs. BrdU and CFSE labeling can be used for short time tracing, and GFP labeling for long time tracing. 5 }- c) _! r& N& @) B& l. w+ k" O; `- C 2 [2 {* f/ ]6 O$ a2 d 【Keywords】 GFP; BrdU; CFSE; MSCs / K* |0 Y6 ^# J. N8 \2 A% } 5 p1 a. j/ U6 @$ D 0引言 \5 W* i6 G8 D+ u1 ^9 |
5 R/ C8 m2 H% [$ W8 c" N( i
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是定居于骨髓微环境中的一种成体干细胞. MSCs不仅能分泌多种细胞因子调节造血细胞的增生与分化，还具有自我增殖、多向分化的潜能［1］. 因其采集方法简单、能在体外大量扩增、可自体移植避免免疫排斥和伦理问题，已成为组织修复的理想种子细胞和基因治疗的靶细胞［2］. 而寻找合适的标记方法用于追踪观察MSCs在实验研究中是很重要的. 目前常用的标记方法包括：溴脱氧尿嘧啶（5bromodeoxyuridine, BrdU）、荧光染料（如二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，5,6carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记. 我们从标记率、MSCs的生物学特性和表面标志的表达等方面对这三种标记方法进行较全面的比较.3 w4 V' X+ j! a! O: W2 \3 K
& Z0 x+ A, X+ Q/ k, _
1材料和方法. ]3 z" V6 A2 D( n) ~1 ~
$ L( C/ p$ U: D3 Q
1.1材料近交系SPF级6~8周龄Wistar大鼠20只，雌雄不拘，体质量120~150 g，由广东省动物中心提供. DMEMF12培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），CFSE（Sigma公司），BrdU（Sigma公司），小鼠抗BrdU抗体（Chemicon公司），山羊抗小鼠FITC（Santa Crutz公司），AdGFP（珠江医院妇产科构建），CCK8试剂盒（Dojindo公司），磷酸盐缓冲液（PBS，武汉博士德公司）. CO2培养箱（Shell公司），荧光显微镜（Leica公司），流式细胞仪（Becton Dickinson公司）.1 P7 x7 [1 D& K" k/ x! W+ |6 U
2 \$ h( H/ `, P 1.2方法 8 F( q9 ^5 x- _2 E7 {* V3 R 0 U: w- N: J0 P0 g1 F 1.2.1大鼠MSCs的分离、培养及扩增用100 g/L水合氯醛麻醉大鼠后，无菌条件下取出胫骨和股骨，制备单细胞悬液，小心加入预先有密度为1.083的Percoll分离液的离心管内，两种液体体积比为1∶1. 离心后，小心吸取中间界面乳白色的单个核细胞层，用PBS洗2次后加完全培养基（含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基）重悬，接种培养. 待细胞铺满瓶底的80%~90%时，按1∶2传代. 本实验中选用生长良好的第3代大鼠MSCs.) h3 P$ C" n7 r0 L/ x. l
; ?' E7 U* A( Z% e3 {( A0 o! ?; F 1.2.2BrdU标记方法及标记率的检测待细胞长至约50%融合时，吸弃培养基，加入BrdU浓度为10 μmol/L的培养基，置培养箱中孵育48 h. 弃去培养基，PBS清洗，以40 g/L多聚甲醛固定30 min. 再用PBS清洗3次后，加入10 g/L牛血清白蛋白，甩净余液后，加入小鼠的抗BrdU抗体，于湿盒中37℃孵育4 h，PBS清洗3次后，避光加入山羊抗小鼠FITC荧光抗体，避光孵育1 h，PBS清洗3次后，荧光显微镜下观察细胞的即时标记情况. 随机选取5个视野，平均标记率，即为BrdU的即时标记率. 同批BrdU标记的大鼠MSCs继续培养、传代，分别于15，30 d后再检测标记率. % m+ e/ j0 }! w, U9 [0 Y" n! Y " { F8 a3 ~0 C0 \, k" ?$ b 1.2.3CFSE标记方法和标记率检测待大鼠MSCs长至约铺满瓶底的80%时，加入CFSE，并使其终浓度为5 μmol/L，置培养箱中继续孵育40 min. PBS洗3次后，流式细胞仪检测荧光标记率，以未标记的MSCs作为对照. 同批CFSE标记的大鼠MSCs继续培养、传代，分别于15，30 d后再检测标记率. : F) r5 }; ~( \ & W- g. s1 l$ @! f, c3 p8 l8 d5 F# T 1.2.4AdGFP标记方法和标记率的检测取病毒储存液在HEK293细胞中反复扩增，收集培养上清及细胞，反复冻溶破坏细胞离心取上清、过滤除菌，氯化铯密度梯度离心法进行纯化，空斑实验法测定转染液病毒滴度为21013 pfu／L. 待大鼠MSCs长至约铺满瓶底的80%时，加入感染复数（multiplicity of infection，MOI）为100的AdGFP，并于12，24，48和72 h，于荧光显微镜下观察标记情况. GFP标记72 h后，以未标记的MSCs做对照，用流式细胞仪进行荧光标记率检测. 同批GFP标记的大鼠MSCs继续培养、传代，分别于15，30 d后再检测标记率.7 b' L8 V4 B, d, [% _7 P) F% n. e
$ D. h1 H$ J3 j. c: Y 1.2.5细胞周期和凋亡率的检测标记后24 h， MSCs经胰酶消化后，以PBS重悬为细胞密度为1109/L的单细胞悬液，用流式细胞仪检测不同方法标记的MSCs的细胞周期和凋亡率. ! a3 n) W6 ^% } ^* A. O$ h# ]! k, H# {
1.2.6表面标志检测三种方法标记及未标记的大鼠MSCs分别用胰酶消化、PBS洗涤后制成109/L的单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞表面CD29，CD34，CD44，CD45的表达.: R9 u% b. \1 a
8 b8 h, ^1 n2 {* P# M$ L" ?1 o: P 1.2.7细胞增殖能力检测应用CCK8试剂盒检测分别用三种方法标记及未标记大鼠MSCs的增殖能力，并绘制生长曲线. 于96孔板的每个孔中加入100 μL细胞悬液，细胞数为1103个. 于细胞接种后的7 d内，每天取5个孔进行检测，每个孔内加入CCK8试剂10 μL，置培养箱内孵育4 h后，用全自动酶标仪检测A450 nm值. 取其均值，以培养时间为横坐标，以相应的A450 nm为纵坐标，描绘生长曲线.. f' r# L* z) l# ]/ C A
3 q2 U4 j) }2 B) |% X: E, w& M 统计学处理：数据以x±s表示，用SPSS12.0统计软件处理，采用单向方差分析（Oneway ANOVA），组间比较采用多重比较SNK法.! q) }& b" `( A5 b- z2 W/ }8 r
5 v; {+ L* Q, u2 d {' V; }
2结果* R9 ]; Y; H3 G, I
5 `4 z- |1 v3 |! m) h% v$ O. ]. ^/ Y
2.1大鼠MSCs培养接种后24 h，细胞为圆形，部分细胞贴附于瓶底，折光性较强. 72 h后绝大部分细胞贴壁，梭形，呈集落样生长，折光性差. 培养7~10 d后，集落增多融合成片，铺满瓶底的80%，可进行细胞的首次传代. 传3~4代后，细胞为长梭形，形态均一，排列有序（图1）.1 h- n1 J' b% O# _; _ x
1 C/ I) Y# u) [4 |4 |9 B* C( W5 L* r 2.2三种方法的标记率三种方法的即时标记率、15 d标记率和30 d标记率见表1. AdGFP感染大鼠MSCs后24 h即可见到有绿色荧光蛋白的表达，以后逐渐增强，72 h可见到较强的绿色荧光，之后表达趋于稳定（图2）. 病毒感染复数（MOI）大于100时，细胞病理现象明显，细胞的正常增殖受影响(本实验中的标记率及其余指标均在MOI为100的条件下测定).表1三种方法的标记率(略）" b( C' v$ ~/ \/ ]- T" S
) u$ S( X" b: b* F* V6 R
2.3细胞周期和凋亡率未标记及标记的大鼠MSCs，大部分细胞处于静止期及DNA合成前期（G0/G1期），只有少数处于有丝分裂期和DNA合成期（S期和G2M期），4组细胞各期的细胞比例无明显统计学差异（P>0.05）. 未标记组，BrdU，CFSE，GFP标记组的凋亡率分别为：(3.6±0.9)%，(3.7±0.5)%，(3.3±0.8)%，(3.3±0.6)%，统计学上无显著性差异（P>0.05）., \; a( g/ L M: e
. G, f4 f& I; c( v( k/ X( n' |, e/ ]
2.4表面标志培养的第3代细胞95%以上CD34和CD45阴性，CD44和CD29阳性，证实为间充质干细胞. 3种标记方法均不会影响大鼠MSCs表面抗原的表达（图3）. ! z% z1 G% h( X 3 t0 ?7 d# [4 A. r6 O4 a 2.5增殖能力4组细胞均于第3日至第5日处于快速生长期. 对各个时间点的A值进行单向方差分析，结果表明各组之间无统计学差异（P>0.05）. 1 M; q9 e5 o1 ] m3 y5 W& |1 J/ Z i9 J) o$ c
3讨论 % h$ B: l% I5 p% k4 g9 U' R2 z& a2 ~. i: J( p6 @1 b
由于MSCs具有多向分化的潜能和能进行自体移植的优势，在组织工程和基因治疗中具有广阔的应用前景［3］. 而进行细胞标记、对细胞进行示踪是研究中必不可少的环节. BrdU的标记方法简单易行，标记率较高、安全无毒性. 本结果表明BrdU的即时标记率达76.95%，且不会影响细胞的形态、生长、增殖能力和表面标志的表达. 但是，近年来的研究结果表明，随着细胞的分裂BrdU标记强度会降低或标记丢失，本实验也证实了这一点，因此，BrdU标记适用短期标记MSCs. 此外，已经移植的BrdU标记细胞，在其死亡后，能将BrdU释放出来，并被邻近的受体细胞摄取，从而出现假阳性标记［4］. 9 n7 O7 r2 n+ ~; B8 a$ n 8 q% b# b( D& }% x. u4 ~6 \ 二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）是一种可穿过细胞膜的荧光染料，进入细胞后不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上，且不会引起细胞发生凋亡或死亡［5］. 本实验我们所用的三种标记方法中，CFSE标记方法最简便、标记率最高，几乎达到100%，而且标记细胞形态良好，增殖能力和表面标志的表达不受影响. 细胞经CFSE染色后，在分裂增殖的过程中，标记的CFSE 可平均分配到子代细胞中，使荧光在细胞分裂增殖过程中被逐渐稀释，因而荧光强度逐渐减弱［6］. 本结果表明随着细胞的增殖，标记细胞的荧光强度逐渐减弱，标记率也随之降低，因此，CFSE标记也适用于短时期示踪.3 p6 {3 V# L6 F$ d7 u* f) S
E& {5 _9 Z1 Q0 ~4 i" ^; ^
绿色荧光蛋白（GFP）是从水母中分离获得的一种发光蛋白，其常用标记细胞方式有3种：质粒载体转染、病毒载体转染和绿色荧光蛋白转基因动物. 本实验我们选择的pAdEasy腺病毒表达载体系统，产生的病毒滴度高，转染效率高，表达稳定，其DNA不整合到宿主基因组［7］. AdGFP感染大鼠MSCs 72 h的感染效率将近90%，细胞形态、增殖能力和表面标志不受影响，且可在体外长期稳定表达. 腺病毒对MSCs的感染率不能达到100%,原因可能为MSCs是由处于不同分化程度，且分化程度在不断变化的多个亚群的细胞组成的缘故［8］. 相对于其他两种标记方法，GFP的标记率不及CFSE、病毒载体构建过程比较繁琐，但具有长期稳定的优点，适用于较长时间的示踪. 5 p. x! [" g7 [) o! S% D4 L* g! `. p* v6 Q
BrdU, CFSE和GFP都可用于标记大鼠MSCs，在体外对MSCs的生长特性和表面标志的表达无明显不良影响. BrdU和CFSE标记方法简便，但标记率随着细胞的分裂增殖不断降低. GFP由于标记高效稳定的优点，具有良好的应用前景.6 W8 j/ s% ^; R7 }+ t
【参考文献】7 q3 ?- Q0 p8 I/ i1 S
［1］Vats A, Bielby RC, Tolley NS, et al. Stem cells［J］.Lancet，2005， 366(9485):592-602.) M; C4 n9 a8 b0 g- V1 j6 c5 h
: `1 h$ }. K0 K8 b7 e/ f# M ( f: ~" D4 Q2 c4 Z& P; z9 V$ T* D* O " }# D+ e4 r; |" E& a# D- u0 Q: N. S ［2］Minguell JJ，Erices A，Congel P. Mesenchymal stem cells［J］.Exp Biol Med，2001，226(6)：507-520. ) T' a9 Z5 q8 w) s1 q- ^- ^; c % H' t, }& x' F$ B4 Q2 y9 Y: C! R8 s! D( e
/ ]8 J" v5 ?; ?7 \/ @( |6 n! t
［3］Miura M, Miura Y, Sonoyama W,et al. Bone marrowderived mesenchymal stem cells for regenerative medicine in craniofacial region［J］. Oral Dis，2006，12(6) ：514-522.8 U0 F! m3 n/ E1 n
6 I6 B3 W2 B2 W! F2 O1 p ~4 L/ u 9 C# ~9 P) u; j8 u+ [ Y3 ~2 d ( v: X) D4 {& X6 W% v! x ［4］Burns TC, OrtizGonzalez XR, GutierrezPerez M, et al. Thymidine analogs are transferred from prelabeled donor to host cells in the central nervous system after transplantation: a word of caution［J］. Stem cells， 2006，24(4) ： 1121-1127.* {8 ?, R# H$ P1 u4 m
~9 t* @8 v) ^; ?- D! ^
( t! ~3 y5 `( E" b. S( G2 _' d3 O z6 A2 D! T
［5］Dumitriu IE, Mohr W, Kolowos W, et al. 5,6carboxyfluorescein diacetate succinimidyl esterlabeled apoptotic and necrotic as well as detergenttreated cells can be traced in composite cell samples［J］. Anal Biochem，2001，299(2) ：247-252. " d; `# G/ K; x! q4 I( Y# x; ]6 o . \% D9 F$ D8 ?7 _: P3 Y5 _% V% s 7 l B5 U0 `6 @+ D; |/ W5 v, L6 v: P% ~' y! ^) U }, T d
［6］Oostendorp RA, Audet J, Eaves CJ. Highresolution tracking of cell division suggests similar cell cycle kinetics of hematopoietic stem cells stimulated in vitro and in vivo［J］. Blood，2000，95(3) ：855-862.$ w7 d8 B2 }6 v& j. c$ _
0 m) g9 Q" m: N7 K9 @0 T4 i
5 K% _0 l( W4 k' C! y4 d1 f. @% z9 e0 S9 w7 U" m
［7］St George JA. Gene therapy progress and prospects:adenoviral vectors［J］. Gene Ther，2003，10(14)：1135-1141. & R; q( h2 l( H( {+ Q* \ q3 P+ I1 K$ p& p( ^
6 x; f' R4 U, I8 [" [
3 |' I& b9 R' M ［8］Preston SL, Alison MR, Forbes SJ, et al. The new stem cell biology: something for everyone［J］. Mol Pathol, 2003，56(2) ：86-96.作者: dypnr 时间: 2015-5-31 08:35