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标题: 这是正常的小鼠胚胎干细胞集落吗？ [打印本页]

作者: lihaining1110 时间: 2010-12-21 11:14 标题: 这是正常的小鼠胚胎干细胞集落吗？

本帖最后由 lihaining1110 于 2010-12-21 11:15 编辑
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这是正常一比五传代后第一天的细胞，大家帮我鉴定下看集落形态正常吗？谢谢了。没有用滋养层，而是添加LIF培养的。, j) f. u6 C& C( ^8 F

作者: starlancer 时间: 2010-12-21 11:47

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非常不正常。虽然没用过无饲养层法培养，但这些细胞的状态明显不对，没看到明显的esc特征集落，看起来像是分化的细胞，有些甚至看起来有点像癌细胞。而且细胞碎片这么多，建议优化培养条件。

作者: lihaining1110 时间: 2010-12-21 12:01

回复 starlancer 的帖子4 p7 t8 C. g- S& T0 |
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正常的细胞集落是什么样子的呀？我用胰酶消化后也是小而园的单个细胞，不知道能不能说明没有分化呢？谢谢啦。- Y3 M, i+ s7 R+ n2 ~! ~/ V- N

作者: BIOLOGY 时间: 2010-12-21 12:45

看着挺不像的，我认为不能消化完了以后是小而圆的细胞就说是否分化，可以做个染色看一下。一般情况下小鼠ES的克隆是比较规则的梭形或者圆形，不像你的图片上的那么不规则。仅供参考啊

作者: lihaining1110 时间: 2010-12-21 13:01

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谢谢. ?) z5 u% U2 z9 W# ?- ^- T4 w/ `. }

作者: lihaining1110 时间: 2010-12-21 13:01

回复 BIOLOGY 的帖子! ?" m+ F9 J* V8 G

谢谢

作者: lihaining1110 时间: 2010-12-21 13:01

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谢谢

作者: BIOLOGY 时间: 2010-12-21 13:12

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1 s9 f. o0 G) x9 a F
客气啦，呵呵

作者: hcluo 时间: 2010-12-21 13:51

边缘紧密，成圆形或椭圆形状的聚集物，这才是ES集落的典型特征吧。

作者: starlancer 时间: 2010-12-21 14:52

回复 lihaining1110 的帖子/ }1 l0 V, X4 O* `1 g
! Q0 r7 {5 H+ O% ]
esc的图片网上随便都可以搜到。esc培养过程中分化是难免的，只是比例的问题。你上面的图不仅仅是分化的问题。

作者: lihaining1110 时间: 2010-12-21 15:18

回复 starlancer 的帖子1 t) W# ?$ `4 }/ C. w( i$ y8 k7 T+ |
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是不是这细胞现在已经没有利用价值了？

作者: lihaining1110 时间: 2010-12-21 15:19

回复 starlancer 的帖子$ z/ \: P7 `8 [/ x; l

这细胞可以弃掉了？

作者: starlancer 时间: 2010-12-21 16:03

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重新解冻吧

作者: igdb 时间: 2010-12-21 17:31

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作者: mbjane 时间: 2010-12-21 17:40

学习

作者: chochochocho 时间: 2010-12-21 18:10

不光是有分化，没做过不用feeder的不过怎么感觉这么乱啊，而且你的照片怎么拍的呢？像是用照相机透过目镜照的，不清楚。

作者: lhw7514093 时间: 2010-12-22 23:06

无EF的形态就是不如有EF的形态好，

作者: lihaining1110 时间: 2010-12-23 18:01

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谢谢，很有用、

作者: ndwzf 时间: 2010-12-28 20:14

应该不是。有饲养层莫？

作者: syl82 时间: 2011-2-15 19:53

本帖最后由细胞海洋于 2011-2-15 23:30 编辑 ) R$ g  ]& W; o7 o7 Y2 I. r$ `
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常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例。 + l. o1 f5 Q8 C' W4 a# t2 @

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小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏   u& v  I6 [6 B4 t& p
胚胎干细胞一般是在37℃、5%CO2和95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）。因此要先铺滋养层细胞。

在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞。
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的MEF培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 9 q6 Q. c/ ~/ o+ T" m' [9 s
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO），用10ml预热的MEF培养基重悬细胞后，加到一个10cm的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
根据情况对细胞进行换液，大约4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于制备滋养细胞层。 4 d  k& O  X- z
滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 6 M3 n' p( B, _3 X' E; @
把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入10ml新鲜的MEF培养基，并在避光的条件下加入110μl配好的丝裂霉素C，混匀后放入培养箱培养2h。 ! q9 f# J* {& t; Z
把含有丝裂霉素C的培养基用无菌的15ml离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使用该培养基处理细胞5h）。用PBS(不含二价离子)洗涤细胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约3min，直到细胞悬浮起来。 9 T' v7 f/ w( d
用1ml MEF培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。
去掉上清，用1ml MEF培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过0.1%明胶处理过的细胞培养皿中，用MEF培养基培养细胞。（明胶处理：加5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在37℃培养箱中至少放置10min，之后把明胶吸掉即可）
一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在1~2h之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可用来培养小鼠胚胎干细胞。制备好的滋养细胞层可以在MEF培养基中保持1周左右的时间，或者是把细胞冻存。 % T3 F; W# @  Z1 [: `/ G8 `& Y
小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏
在37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。 6 m, r; u! }) o9 f/ j) @. Q7 `8 p
把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的ES培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ，5min离心收集细胞。 / ?- H/ \6 [, b- ~; J( n; q: i# ]
吸掉上清（除去冻存液中的DMSO，用10ml预热的ES培养基重悬细胞后，加到一个10cm的铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，放入37℃，含有5%CO2的加湿培养箱中培养。
根据情况对细胞进行换液，大约3~4天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存或用于后续试验。
小鼠胚胎干细胞的传代
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 6 `. J! x6 t" p! \3 @7 O, q% h
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 3 i% L# H3 I1 l$ `% O  c) e# c
去掉上清，用几毫升ES培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有滋养细胞层的细胞培养皿中，加ES培养基培养。ES细胞的分配比可以是1:1到1:10。
小鼠胚胎干细胞的冻存
吸掉培养基，用PBS(不含二价离子)洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化细胞，37℃培养箱放置约5min，直到细胞基本悬浮起来。 ' V! W" J$ M6 ]) {+ ?0 ]+ A. @/ P
用1ml ES培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g离心5min。 ; g+ h) P- D" t4 L& t6 P& d6 I
去掉上清，用预先配制好的预冷的ES细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管），按每管1ml的量分装到冻存管中。梯度降温：4℃20min，-20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中。 7 A5 f9 z5 C, m: F% O
注意事项 % N. h2 s. J) \8 n; M
丝裂霉素C在操作时要避光，避免其分解。 0 J; X  L* u* i4 V3 O* @8 ]/ W/ n
ES细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 # k$ _4 b1 _6 a) o
ES细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化。
为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。

作者: esc123esc 时间: 2011-2-17 16:18

分化是肯定的了，不用feeder的话，基因表达是有变化的，外在看来就是克隆的外形变化了，我做过一个分化相关的基因，和你同样的条件也是出现了这种细胞状态，检测发现这个分化基因确实是表达上调了，ORZ...如果你想要多能型好一点的ES，还是不要这样养了~

作者: wwwsdzsgov 时间: 2011-2-25 17:33

好像贴壁了

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